176142. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tisztított albumin kinyerésére vérplazmából
3 176142 4 2. Makroaggregátumok és albumin ditnerek, amelyek elkülönítését — kielégítő mértékben — mind ez ideig nem sikerült megoldani. Ring és társai vizsgálataik alapján beszámolnak arról, hogy az aggregátum-tartalmú albumin infúzió alkalmazása komoly anaphylaxiás reakciókhoz vezet, míg az aggregátumokat nem tartalmazó oldatokat a betegek jól tolerálják (Monogra., Allergy, 12, 27—35, 1977). A találmány célja olyan eljárás kidolgozása, amely lehetővé teszi az albumin igen tiszta formában és magas kitermeléssel történő előállítását az emberi vérplazmából és ugyanakkor megfelel az intravénás alkalmazás követelményének is. Fentieken túlmenően az eljárásnak olyannak kell lennie, hogy a plazmában levő egyéb proteinek (különösen az immunglobulin) az eljárás során ne károsodjanak, sőt olyan formában maradjanak, amely lehetővé teszi azok tiszta formában történő előállítását is (No—212 számú magyar szabadalmi bejelentés). Tekintettel arra, hogy az emberi vérplazma erősen korlátozott alapanyagforrás, a cél elsősorban azon lehetőségek kiaknázására irányul, amelyek a konzerválás alkalmazásában és nem az egyéb proteinek (különösen az immunoglobulin) denaturálásában rejlenek. A találmány azon a felismerésen alapul, hogy egyszerű módon, alkoholok alkalmazása nélkül összekapcsolható az albuminok polietilénglikol jelenlétében történő frakcionált kicsapása a stabilizátorként alkalmazott kaprilsav jelenlétében való hőkezeléssel, és akkor kottgulálnak azok a szennyező anyagok, amelyek egyébként az albuminnal együtt kicsapódnának. Ennek következtében a találmány szerinti eljárás kedvező termeléssel szolgáltat igen tiszta albumint. A találmány szerint úgy járunk el, hogy vérplazmát polietilénglikollal elegyítünk, a pH-t 6—7 közötti értékre állítjuk be, és így a fibrinogént és a globulinokat leválasztjuk, a felül úszó folyadékot, amely 150—300 g/1, célszerűen 180—200 g/1 polietilénglikolt tartalmaz, 4,5— 5,3 közötti pH-értékűre állítjuk be, az albumint leválasztjuk, a polietilénglikolt tartalmazó albumint vizes közegben ismét feloldjuk, a kapott albumin-oldatot 50—65 °C-on és 4,6—5,0 közötti pH-értéken kaprilsav jelenlétében termokoagulálásnak vetjük alá, s a tisztított albumint az oldatból kicsapjuk. Vérplazmaként előnyösen stabilizált vérplazmát alkalmazunk, és ehhez adjuk hozzá a polietilénglikolt a kicsapáshoz szükséges mennyiségben, amely például 150—300 g/1 lehet. Polietilénglikolként például 4000-es molekulasúlyú polietilénglikolt használunk, azonban ennél nagyobb vagy kisebb molekulasúlyú polietilénglikol is alkalmazható, így 1000—50 000 közötti molekulasúlyú. A globulint tartalmazó frakció leválasztását 6—7 közötti pH-értéken végezzük, az optimális pH-érték azonban 6,7 körül van. A csapadékot célszerűen centrifugálással különítjük el, majd az így kapott, albumin-tartalmú oldat pH-ját 4,5—5,3 közötti értékre, célszerűen 4,9-re állítjuk be. Ekkor leválik az albumint tartalmazó frakció. Ez a frakció fehérjéket, szennyező anyagokat és polietilénglikolt is tartalmaz. A csapadékot vízben oldjuk, úgy, hogy a kapott oldat koncentrációja előnyösen 80 g/1 legyen. Ezután kaprilsavat adunk az oldathoz, például 2—3 g/1, előnyösen 2,5 g/1 mennyiségben. Az oldat pH-ját 4,6—5,0 közötti értékre, célszerűen 4,8-re állítjuk be, majd 50—65 °C-ra, célszerűen 60 °C-ra melegítjük. A hőkezelést általában 30 percig végezzük. A hőkezelés hatására a még jelenlevő szennyező fehérjék koagulálódnak. Ha a hőkezelést kaprilsav hozzáadása nélkül végeznénk 55 °C feletti hőmérsékleten, az albumin egy része elbomlana, és a termelés igen gyenge lenne. A hőkezelés után a terméket lehűtjük, és a koagulátumot centrifugálással vagy szűréssel elválasztjuk. A centrifugált vagy szűrt oldatban jelenlevő tisztított albumint önmagában ismert módon, kicsapással különítjük el. Például úgy járhatunk el, hogy 40%-os etanolt adunk az oldathoz, a tisztított albumint 4,8-es pH- értéken 0 °C alatti hőmérsékletre történő hűtéssel kicsapjuk. Az albumint például centrifugálással vagy fagyasztva szárítással különítjük el. A találmány szerinti eljárás előnye, hogy alkalmazásával egyszerű módon állíthatunk elő rendkívül tiszta albumint kedvező hozammal. Továbbá a találmány szerinti eljárás iparilag is jól kivitelezhető. A találmány szerinti eljárásnál elkerüljük a globulinok denaturálását, és ezért az ezeket a fehérjéket tartalmazó frakciók is feldolgozhatok, és belőlük jó termeléssel és tiszta állapotban nyerhetők ki az értékes globulinok. Jóllehet önmagában, külön-külön ismert a polietilénglikol jelenlétében történő kicsapás és a termokoagulálás, mindeddig senki nem kísérelte meg ezeknek a tisztítási módszereknek az összekapcsolását. Meglepő módon, a tisztítási módszerek összekapcsolásával elkerülhetjük az albumin denaturálását, és ennek következtében jó termelést érünk el. Semmiképpen nem volt előre látható az sem, hogy a találmány szerinti eljárás egyidejűleg a termék tisztaságát is jelentős mértékben megnöveli. A találmány szerinti eljárás egy további előnye, hogy kiindulási anyagként vérplazmát alkalmazunk. Ez azért lehetséges, mivel a globulinok, amint erre fentebb már utaltunk, nem denaturálódnak, és így kedvező termeléssel szintén elkülöníthetők és felhasználhatók. A találmány szerinti eljárást az alábbi példa segítségével részletesen ismertetjük. Példa 100 liter, citráttal stabilizált emberi vérplazmát 137 liter 33 súly%-os vizes polietilénglikol-oldattal elegyítünk. A képződő oldatban a polietilénglikol 3000 koncentrációja 19 súly%. Az oldat pH-értékét 6,7 ±0,l-re állítjuk be, az elegyet 45 percig állni hagyjuk, majd centrifugáljuk. A csapadék fibrinogénből és globulinból áll, a felül úszó folyadék tartalmazza az albumint. Az albumin-tartalmú felülúszó savasságát ecetsavval 4,8— 5,0 közötti pH-értékre állítjuk be. A képződő csapadékot, amely albuminból áll, centrifugáljuk. Az albumint 80 liter desztillált vízben körülbelül 40 °C-on oldjuk, és 200 ml kaprilsavat adunk hozzá. Az oldat pH-ját 1 M vizes nátriumhidroxid-oldattal 4,8 ±0,1 értékre állítjuk be, majd az oldatot 30 percig hevítjük 60 ±0,5 °C-on. A képződő csapadékot centrifugáljuk, az oldatból az albumint 40%-os etanollal —5 °C-on, pH=4,8 értéken kicsapjuk. A kicsapott albumint centrifugáljuk és fagyasztva 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
