176104. lajstromszámú szabadalom • Új eljárás (+) 13ß-alkil-3-metoxi-17-oxo-gonaének mikrobiológiai előállítására
3 176104 4 fala áthatolható a természetes forrásban elő nem forduló, szubsztrátumként adott rac-13 ß-alkil-3-metoxi-17 3-hidroxi-gonaének számára. Ez a baktérium a kiindulási vegyületből az egyik antipód oxidált termékét állítja elő, miközben a másik változatlanul visszamarad a fermentlében, amiből a két antipód szétválasztása önmagában ismert módszerek felhasználásával könnyen kivitelezhető. Az általunk kiválasztott mikroorganizmus a norszteroid molekula 17-hidroxi csoportjának sztereoszelektív oxidációjára képes nemcsak a természetes ösztradiol, hanem ennek szintetikus homológjai esetében is. Sőt amint azt az 1. példa mutatja, a norszteroid szintézis egy korábbi intermedierjének a, d-13ß-etil-3-metoxi-gona-l,3,5(10)8-tetraén-17ß-ol-nak a sztereoszelektív előállítására is alkalmas, amire ezideig mikrobiológiai eljárás nem ismeretes. A fentiek alapján a találmány tárgya új eljárás (+) 13 3-alkiI-3-metoxi-17-oxo-gonaének előállítására I általános képletű racém gonaének — ahol R jelentése metilvagy etil-csoport, Z jelentése pedig II, III vagy IV képletű csoport — sztereoszelektív mikrobiológiai oxidációjával. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy az I általános képletű racém gonaén származékokat — ahol R és Z jelentése a fenti — Mycobacterium sp. MP—2 (MNG 167) jelű mutáns törzs süllyesztett, levegőztetett és kevert tenyészetével vizes közegben kezeljük, és a képződő jobbraforgató 17-oxo-vegyületeket ismert módon elkülönítjük. A találmány értelmében célszerűen úgy járunk el, hogy Mycobacterium sp. MP—2 jelű mutáns törzs növényi eredetű fehérjét és szénhidrátot, célszerűen burgonyakivonatot és glükózt tartalmazó agar-táptalajon 5—10 nap alatt 30—40 C°-on, célszerűen 37 C°-on kifejlődött tenyészetének steril desztillált vízzel készült szuszpenziójával olyan 121 C°-on 30 percig sterilezett folyékony táptalajt oltunk, amely 1—4% koncentrációban növényi és állati eredetű fehérjét, ezen belül előnyösen 2% kukoricalekvárt, 0,6% peptont, 0,2% húskivonatot, 0,1% élesztőkivonatot és 1—3% szénhidrátot, előnyösen 1% glicerint tartalmaz. A tenyésztést 30—40 C° között, előnyösen 37 C° hőmérsékleten végezzük Erlenmeyer lombikban, szitarázógépen. Az etanolban oldott szubsztrátumot célszerűen 48 óra növekedés után adjuk a tenyészethez, de adagolható ez időpont előtt vagy ez után is. A tenyésztéssel azonos körülmények között végzett inkubálás alatt a fenti enzimatikus átalakítás 1—2 nap alatt befejeződik. A biokémiai reakció előrehaladását rétegkromatográfiás módszerrel vizsgáljuk, vagy pedig a képződött 17-oxo-származék mennyiségét — 2,4-dinitrofenilhidrazinnal reagáltatva, a keletkező hidrazon szín intenzitását mérve — határozzuk meg. A természetes konfigurációjú származék 80—90%-ának dehidrogénezése után a reakcióelegyet szupercell segítségével szűrjük, a kiszűrt sejttömeget és az ezzel együtt kiszűrt szteroid-származékokat (az át nem alakult enantiomer és az oxidált antipód elegye) szárítjuk, majd vízzel elegyedő oldószerrel, célszerűen acetonnal az utóbbiakat leoldjuk. A sejtmentesre szűrt acetonos oldat bepárlásával nyert szárazmaradékot klórozott szénhidrogénben, célszerűen kloroformban oldjuk, majd vízmentesítés után szárazra pároljuk. A szárazmaradékból optikailag tiszta termékhez több úton juthatunk. Az egyik módszer szerint a szárazmaradékot szilikagélen megkötjük, majd etilacetát-ciklohexán rendszerrel eluáljuk a 17-oxo-származékot, amit végül metanolban átkristályosítunk. A másik módszer szerint a szétválasztást származékképzésen keresztül valósíthatjuk meg, célszerűen a 17- -oxo-származék szemikarbazonját előállítva. A képződött, majd elkülönített szemikarbazont megbontva, az optikailag tiszta 17-oxo-13p-alkil-3-metoxi-gonán-származékot kapjuk. A találmány szerinti eljárásban szubsztrátumként használt I általános képletű — ahol R és Z jelentése a fent i — racém 13 ß-alkiI-3-metoxi-17 ß-hidroxi-gonacne k rezolválására kémiai út is ismeretes. Ilyet ismertet például a 3 418 326 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, azonban mégis előnyösebb a mikrobiológiai út használata, mert az átalakítást végző enzim nagyfokú specificitása rövid fermentációs idő alatt biztosítja az optikailag tiszta végtermék előállíthatóságát. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg: 1. példa Mycobacterium sp. MP—2 (MNG 127 sz. alatt deponálva) törzs 0,8% burgonyakivonatot, 2% glükózt és 1,5% agart tartalmazó táptalajon 37 C°-on nőtt 10-napos tenyészetét steril desztillált vízben szuszpendáltuk. A sejtszuszpenzió 1 ml-ével 500 ml-es Erlenmeyer lombikba bemért 1% kukoricalekvárt, 0,6% peptont, 0,4% húskivonatot és 0*2% élesztőkivonatot tartalmazó 100 ml táptalajt oltottunk, majd 37 C°-on szitarázógépen percenként 300 fordulattal 2,5 cm átmérőjű kör kerületén mozgatva levegőztettük, 48 óra növekedés után 1 ml forró etilalkoholban oldva (50 mg/ml koncentrációban) adagoltuk hozzá a táblázatban feltüntetett szubsztrátumot. A tenyésztést tovább folytattuk mindaddig, amíg az egyik antipód (a természetes sorbeli) oxidálódott. A reakció előrehaladását, a lombik tartalmát metilénkloriddal extrahálva, rétegkromatográfiás félkvantitatív módszerrel követtük. A kapott eredményeket táblázatban foglaltuk össze. 2. példa Mycobacterium sp. MP—2 (MNG 127) ferdeagar tenyészetével 5 db 500 ml-es Erlenmeyer lombikban 0,2% ammónium-dihidrogén-foszfát-ot, 0,2% kálium-dihidrogén-foszfát-ot és 0,5% élesztőkivonatot tartalmazó, 121 C°-on, 30 percig sterilezett 100—100 ml táptalajt oltottunk, majd 37 C°-on szitarázógépen 300 fordulat/perc (2,5 cm átmérő) rázási sebességgel levegőztettük. 48 óra növekedés után a fenti lombikokban kinőtt 0,5 liter tenyészettel 10 literes üvegfermentorban sterilezett 5 liter térfogatú táptalajt oltottunk, ami 1,5% kukoricalekvárt, 0,6% peptont, 0,4% húskivonatot, 0,2% élesztőkivonatot és 0,01% polipropilénglikolt (MS 2000) tartalmazott. A baktériumsejteket 37 C°-on növesztettük, miközben a táptalajt 2,5 liter levegő átfúvása mellett 450 fordulattal kevertük. 30 órás növekedés után 100 ml etanolban oldva 10 g ( ± )13 ß-etil-3-metoxi-l ,3,5- (10)-gonatmn-17ß-olt adagoltunk, és az inkubálást folytattuk, hat óránként mérve a képződött oxo-származék mennyiségét. Egy és fél nap inkubálás után 85%os konverziót értünk el, ekkor a fermentor tartalmát 30 g szupercell segítségével szűrtük. A szteroid tartalmú 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
