176103. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nembramicin-komplex előállítására mikrobiológiai úton
5 176103 6 rezisztens törzseket kapunk, amelyek megfelelő táptalajon tenyésztve a kiindulási törzsnél legalább háromszor több nebramicin-2-t és/vagy nebramicin-5'-t szintetizálnak. Két ilyen törzset letétbe helyeztünk az Országos Közegészségügyi Intézet Nemzeti Törzsgyűjteményében, ahol az MNG 169 és MNG 170 sorszámot kapták. A találmány szerinti eljárás legfőbb előnye, hogy segítségével az eddiginél legalább háromszor több nebramicin-komplexet, nebramicin-2-t és nebramicin-5'-t tartalmazó tenyészlevek állíthatók elő. A nagy mennyiségű antibiotikumok bioszintézisére képes törzsek egyszerűen kivitelezhető, gazdaságos módon izolálhatok, és ezek a törzsek termelőképességüket hosszú időn át beavatkozás nélkül megtartják. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi kiviteli példákkal részletesen szemléltetjük. 1. példa a) Nebramicin-2-re rezisztens Streptomyces tenebrarius (MNG 169) izolálása A Streptomyces tenebrarius spóráival vagy vegetatív tenyészetével a következő összetételű, desztillált vízzel készült táptalajt oltjuk : dextrin 1,0% élesztőkivonat 0,1% kazein-hidrolizátum (10%-os) 2,0% húskivonat 0,1% kobalt(II)-klorid—víz (1/6) 0,001% agar 2,0% A táptalaj pH-ját sterilezés előtt nátriumhidroxiddal 7,2-re állítjuk be, a sterilezést 121 C° hőmérsékleten 20 percen át végezzük. Négy napon át 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészeteket, majd milliliterenként 5 x 107— Ï08 spórát és 100 fzg/ml 8-metoxi-pszoralént tartalmazó 7,0 pH-jú foszfát-pufferes spóraszuszpenziót készítünk, ismert mó- 5 don. A spóraszuszpenziót szűrés és homogenizálás után 15 W-os fényforrásból eredő ultraibolya fénnyel besugározzuk, a fényforrás és a szuszpenzió felületének távolsága 20 cm. A 3 percig tartó kezelés közben 10 másodpercként mintákat veszünk, amiket megfelelő 10 hígítást követően a fentiekben megadott összetételű, továbbá 2, 5, 10 és 20 mg/ml nebramicin-2-vel kiegészített szilárd halmazállapotú táptalajokon szélesztünk. Négy napon át 37 C° hőmérsékleten növekvő és spórázó telepeket hasonló összetételű és azonos mennyiségű 15 nebramicin-2-t tartalmazó ferdeagarokra oltjuk, majd 37 C° hőmérsékleten négy napon át inkubáljuk őket. Kontroll vizsgálatokra izoláljuk és tenyésztjük a nebramicin-2-t nem tartalmazó táptalajon kinőtt telepek egy részét is. 20 A kinőtt tenyészetekkel az ld példában megadottak szerint eljárva rázott tenyészeteket oltunk, majd a fermentációt követően vizsgáljuk a fermentlevek össz-hatóanyag tartalmát, és közelítő pontossággal meghatározzuk a termelt antibiotikum-keverék összetételét. 25 A legtöbb antibiotikumot a legelőnyösebb összetételben bioszintetizáló törzsekkel megismételjük az előzőekben ismertetett, mutációt kiváltó és a nebramicin-2-veI szembeni rezisztenciát fokozó kezelést, majd az izolált törzsek termelőképességét ismételten vizsgáljuk. A nagy 30 mennyiségű nebramicin-5'-t és nebramicin-2-t termelő törzseket felhasználásig hűtve tároljuk. A mutációs kezelés nélkül szélesztett, továbbá az ultraibolya fénnyel 8-metoxi-pszoralén jelenlétében be- 35 sugárzott és nebramicin-2-mentes, illetve nebramicin-2-t tartalmazó táptalajon való növesztést követően izolált törzsek termelőképességét az 1. táblázatban adjuk meg. 1. táblázat A nebramicin-2 jelenlétében növekvő Streptomyces tenebrarius törzs termelőképessége Kezelt A vizsgált telepek száma (db) A tíz legjobban termelő tőm átlago« termelőképewége* (|ig/ml) A termelt nebramicin-komplex átlagos komponens-összetétele (%)** Termelőképesség a kontroll %-ában nebrainicin-2 nebramicin-4 nebramicin-5' Kiindulási törzs (kontroll) 140 2950 51 35 14 100 Első UV-kezelést követő a) szélesztés táptalajon 21 3010 47 38 15 102 b) szélesztés apramicint tartalmazó táptalajon 92 5480 62 14 24 185 Második UV-kezelést követő a) szélesztés táptalajon 19 3420 52 32 16 116 b) szélesztés apramicint tartalmazó táptalajon 86 9040 68 12 20 306 * A biológiai értékmérést Bacillus subtilis ATCC 6633 mikroorganizmussal és nebramicin-komplex standard anyagot használva végeztük. A standard 3:1:1 arányban tartalmazott nebramicin-2-t, nebramicin-4-et és nebramicin-5'-t. * * A komplex komponens-összetételét kvantitatív vékonyrétegkromatográfiát követő bioautográfiával határoztuk meg. A szilikagél (Merck, Darmstadt, NSZK) vékonyrétegre 0,1—0,5 pg/ml közötti mennyiségű antibiotikumot cseppentettünk, majd futtatóelegyként etilalkohol, metil-etil-keton és 25%-os ammóniumhidroxid 1:1:1 arányú elegyét használva kromatografáltunk. A gél teljes száradása után Bacillus subtilis ATCC 6633 mikroorganizmust tartalmazó táptalajt rét^eztüak a szilikagél felületére és inkubáció utáni standard-del összehasonlítva, meghatároztuk a gátlási zónák nagyságát. 3
