176068. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens a biológiailag aktív heparin meghatározására plazmában
MAGYAR NÉPKÖZTÁRSASÁG SZABADALMI LEÍRÁS 176068 Bejelentés napja: 1979. II. 13. (BO—1763) Nemzetközi osztályozás : w Elsőbbsége : Német Szövetségi Köztársaság 1978. III. 23. (P 28 12 943.3) G 01 N 33/16 ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI Közzététel napja: 1980. VI. 28. HIVATAL Megjelent: 1981. VI. 30. Feltalálók : Szabadalmas : dr. Bartl Knut vegyész, Tutzing, Boehringer Mannheim GmbH., dr. Lili Helmut vegyész, Wielenbach, Mannheim-Waldhof, dr. Ziegenhorn Joachim biokémikus, Starnberg, Német Szövetségi Köztársaság Német Szövetségi Köztársaság Eljárás és reagens a l tív heparin meghatározására in 1 A találmány tárgya eljárás és reagens a biológiailag aktív heparin meghatározására plazmában. A heparin meghatározása fontos paramétere a trombózisveszély esetén rendszerint folytatott heparinterápia folyamat ellenőrzésének. A heparin antitrombin III-mal (AT III) komplexet képez, amely a trombin proteolitikus aktivitását csökkenti. Mivel a trombin fibrinnek fibrinogénből való képződését katalizálja, a trombinaktivitás felelős a vér vagy plazma alvadásáért, és így a trombózis esetén keletkező fibrinalvadékért is. A heparinterápiát főleg trombózisveszély fennállása esetén (például sebészeti beavatkozások előtt) alkalmazzák. A heparinkoncentráció pontos beállítása ekkor rendkívül fontos. Túl alacsony adagolás esetén fennáll a trombózis illetve embólia veszélye, ami halálhoz vezethet. Túl magas heparinkoncentráció ellenben elvérzéshez vezet. A heparin kvantitatív analízise ezért a véralvadásvizsgáló laboratóriumban gyakran elvégzendő vizsgálatokhoz tartozik. A heparin meghatározására a gyakorlatban mindeddig lényegében két módszert alkalmaztak : 1. A vér vagy plazma alvadási aktivitásának meghatározása. Az ezen alapuló eljárások még nem kielégítőek. Alacsony koncentrációtartományban az érzékenység túl csekély, magas koncentrációnál viszont az alvadásképtelenség miatt már nem alkalmazhatók. [Lásd Thromb. Rés, 8, 413 (1976)]. 2. Újabban kromogén szubsztrátokat alkalmaznak az Xa enzimfaktorhoz vagy trombinhoz. [J. Clin. Chem. Clin. Biochem. / 5, 239 (1977)]. Ez az újabb eljárás a következő elven alapul: 2 A plazmamintát, amely a meghatározandó heparint, valamint ismeretlen, változó mennyiségű antitrombint Ill-t (AT III, illetve heparin-kofaktor) tartalmaz, AT III jelenlétében Xa faktorral, illetve trombinnal inkubálják. A hozzáadott AT Ill-nak egyrészt a mintában levő különböző AT III mennyiségeket fölösleg alkalmazásával ki kell egyenlítenie, másrészt az szükséges, hogy a teszt érzékenységét, különösen alacsonyabb heparinkoncentráció-tartományban kielégítően megnövelje. Az AT III normálplazma formájában adható, amely mindig fiziológiás mennyiségű AT Ill-t tartalmaz, vagy tisztított AT III formájában. Az inkubáció során a mintában levő heparin katalitikus úton az AT III konformációváltozását okozza, ami ennek aktiválódásával jár. Az aktivált AT III képes arra, hogy az inkubációs oldatban jelenlevő Xa proteolitikus enzim, illetve trombin egyrészét spontán kialakuló kovalens kötés útján inaktiválja. A heparinnal aktivált AT Ili által nem gátolt proteolitikus enzim egy megfelelő kromogén szubsztrátból, rendszerint egy p-nitro-anilint tartalmazó peptidből, így Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA-ból illetve Tos-Gly-Pro-Arg-pNA-ból képes a p-nitro-anilin színezék felszabadítására, amelynek extinkciója 405 nm-nél mérhető. A hozzáadott enzimaktivitás (AE,/perc) és az inkubáció után mért maradék aktivitás (AE2/perc) közötti különbség kalibrációs görbe segítségével összefüggésbe hozható a mintában levő heparinkoncentrációval. Az alábbi reakcióvázlatok magyarázzák az eljárást : LAT III AT III+ 5 10 15 20 25 30 176068
