175972. lajstromszámú szabadalom • Új eljárás nagytisztaságú szérum-albumin előállítására
5 175972 6 teként előnyösen kb. 6-os pH-érték mellett kinyerjük a 7-globulint. A gyanta-protein elegy pH-ját ezután 4,7-es értékre állítva a felülúszó folyadékból kinyerhetjük az adszorbeált a- és ß-globulin, valamint a fibrinogén egy részét. Ezután 5,0 és 5,5-es értékre állítjuk be a gyanta-protein elegy pH-ját, majd 1,4 órán át 65 °C és 72 °C közötti hőmérsékleten tartjuk az elegyet. Előnyösen 5,2-5,3-re állítjuk be a pH-t, és 70 °C hőmérsékleten tartjuk az elegyet 1 órán át. A fent leírt hőkezelés során az adszorbeáltan maradt globulinok, amelyek lényegében a- és 0-globulinok, denaturálódnak, az albumin viszont nem és így az utóbbit egyszerűen kinyerhetjük. A hőkezelés után a kívánt albuminnak a gyanta-protein elegyből való kinyerése céljából 3,5 és 4,5 közötti értékre állítjuk be az elegy pH-ját. A pH beállítása előtt előnyösen lehűtjük a gyanta-protein elegyet, majd 4-es értékre állítjuk be a pH-ját. Többféle módszerrel, így például ülepítéssel, szűréssel vagy centrifugálással nyerhetjük ki az albumint, előnyösen azonban megszűrjük a megfelelő pH-értékre beállított gyanta-protein elegyet, kimossuk a kiszűrt gyantát, és ily módon szűrletként nyerjük a kívánt, nagytisztaságú albumin-frakciót. A fenti műveletek során olyan savas vagy bázikus pufferanyagokkal állítjuk be az elegy pH-ját a kívánt értékekre, amelyek klinikailag elfogadhatók, így használhatunk például savanyításra nátrium-acetátos-ecetsavas puffert vagy citromsavat, illetve lúgosításra nátrium-hidrogén-karbonátot vagy nátrium-hidroxidot. Ugyancsak előnyös, ha a hőkezelési művelet elvégzése előtt ismert albumin-stabilizáló anyagokat, mint például nátrium-acetil-triptofanátot vagy nátrium-kaprilátot adunk a gyanta-protein elegyhez. A találmány szerinti eljárást a továbbiakban, a találmány oltalmi körének szűkítése nélkül, példákkal szemléltetjük. 1. példa Az ezen példában leírt polielektrolit kopolimer az etilénből és maleinsav-anhidridből nyerhető, lényegében ekvimoláris mennyiségű etilén-egységet és maleinsav-anhidrid-egységet tartalmazó, metil-imino - -bisz-propil-aminnal térhálósított, majd dimetil-amino-propil-aminnal reagáltatott, sósavas só formájúvá alakított polimer gyanta, amely az etilén-(maleinsav-anhidrid)-kopolimer minden 100 maleinsav-anhidrid-egységére számítva körülbelül 5-metil-imino-bisz-propil-amino-csoportot tartalmaz mint térhálósító keresztkötést, és körülbelül 90-dimetil-amino-propil-amino-csoportot mint funkciós csoportot. Először 0,04 mólos nátrium-klorid-oldattal mossuk a polielektrolit kopolimert. Emberi vérből nyert plazmát vízzel eredeti térfogatára számított háromszoros térfogatú vízzel hígítunk, majd hozzáadunk 2súly%-nyi (2 g/100 ml) mosott polielektrolit kopolimert. A gyanta-plazma elegy pH-ját 6,0-ra állítjuk, félórán át keverjük az elegyet, majd megszűrjük, és 0,002 mólos nátrium-klorid-oldattal kimossuk a kiszűrt anyagot, ily módon választjuk el a szűrletben levő 7-globulint, 0-globulint, fibrinogént és más vérfaktorokat a gyanta-protein elegytől, amely a szűrőn marad. Ezután az adszorbeált 5 albumint is tartalmazó kiszűrt gyanta-protein elegy pH-ját 5,2-re állítjuk be. Hozzáadunk annyi nátrium-kaprilát stabilizátort, hogy koncentrációja 0,012 mólos legyen, majd annyi nátrium-kloridot, hogy ennek koncentrációja 0,002 mólos legyen. 10 Utána 1 órán át 70 °C hőmérsékleten tartjuk a gyanta-protein elegyet, majd leszűrjük, és elöntjük a szűrletet. A kiszűrt gyanta-protein elegyből oly módon nyerjük ki az albumint, hogy 0,002 mólos nátrium-klorid-oldattal készült szuszpenzióban cit- 15 romsavval 4,0-re állítjuk be az elegy pH-ját, félórán át keverjük, majd kiszűrjük a gyantát. A szűrlet a kívánt albumin-frakció, termelés: 96,6% (az albuminnak az eredeti plazmában mért koncentrációja alapján), tisztasága: 98,5%. A gyantáról eluált ter- 20 mékben levő albumin tisztaságát Coming ACI elektroforetizáló készülékben, agaróz-gélen, 8,6-es pH-értékű barbitál-pufferben [Analitikai Zsebkönyv, III. kiadás, Műszaki Könyvkiadó, Bp. (1966) 395. oldal] végzett elektroforézis útján határozzuk 25 meg. A meghatározás során lényegében a Fazekas de St. Groth és mások által leírt [Biochim. Biophys. Acta 71, 377—391 (1963)], Coomassie Brilliant Blue R250 (C. I. 42660) előhivási eljárást alkalmazzuk, és a leolvasást 600 nm hullámhossznál 30 egy Gelman ACD-15 denzitométerrel végezzük. A Coomassie Brilliant Blue R250 egy nagyon érzékeny fehérje-előhívószer, amely egészen a 20 jUg/cm-es értékhatárig követi a Lambert—Beer-törvényt, és minimális érzékenysége 0,5 pg/cm. A 35 Coomassie Brilliant Blue R250 ezen nagyfokú érzékenysége révén az albuminban jelenlevő igen kis mennyiségű szennyezéseket is ki lehet mutatni, és a jelen példában nyert terméket a fenti módon vizsgálva meggyőződhetünk róla, hogy az 98%-nál 40 tisztább. 2. példa 45 AHF-mentesített plazmából [J. Arrí. Med. Áss. 205, 613—617] kiindulva, és az 1. példában leírt módon eljárva lényegében az 1. példában leírt termeléssel és tisztaságban nyerjük az albumint. 50 3. példa Az 1. példában leírt módon járunk el, azzal a különbséggel, hogy további globulinok és fibrino- 55 gén kinyerése céljából a hőkezelési művelet előtti szűrés után beiktatunk egy közbenső műveletet, E közbenső művelet abból áll, hogy az első szűrés útján nyert gyanta-protein elegy pH-ját 0,002 mólos nátrium-klorid-oldattal készített szuszpenzióban 60 citromsavval 4,7-re állítjuk be, félórán át keverjük az elegyet, majd szűrjük, kimossuk a kiszűrt anyagot, és ezután végezzük el az 1. példában leírt módon a hőkezelést és az azt követő műveleteket. A 4,7-es pH-n végzett kezelés után nyert szűriet- 65 ben a- é$ 0-globulin és fibrinogén van, ezeket 3
