175950. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új egymagvú coriolus versicolor micelium előállítására
7 175950 S 0,75% élesztő kivonatot (Kyokuto Seiyaku Kogyo Co. Ltd.) tartalmazó táptalajt 500 ml-es Erlenmeyer lombikba pipettázunk és 20 percig gőzsterilizáljuk 120°C-on autoklávban, a táptalajt Imi micélium szuszpenzióval beoltjuk. A micélium szuszpenziót úgy kapjuk, hogy Coriolus versicolor (Fr,) Quél. micéliumot diszpergálunk, a micéliumot úgy állítjuk elő, hogy 25 °C-on 20 napig állandóan tenyésztünk 50ml folyékony táptalajon, amely 3% glükózt és 0,5% élesztőkivonatot tartalmaz 60 ml fiziológiás sóoldatban, miközben 3 percig 6000 percenkénti fordulatszámú keverővei, a micélium nyalábot szétaprítjuk, majd a tenyészetet percenként 200 rezgésszámmal 25 °C-on rázni kezdjük. A tenyésztés elkezdése után 3 nappal a tenyésztett anyagot aszeptikusán 200 ml-es keverő edénybe (Sakuma Seisakujo) vezetjük, majd az anyagot homogenizálóban (Sakuma Seisakujo) 10000 percenkénti fordulatszámmal 10 percen keresztül őröljük és utána azonnal rázni kezdjük és összesen 7 napig tenyésztjük rázás közben. Az így kapott tenyészetnek nincs „damp” kapcsolása és a iégmicélium egy standard agar lemez táptalajon gyengén szaporodik. A mikroszkópos vizsgálat eredménye a megfestés után azt mutatta, hogy a kapott micéliumok mind monokarionosak voltak. Megfestés: 1 ml fent leírt módon előállított táptalajt 10 ml vízhez adunk, majd 5 perág centrifugáljuk 2000-5000 g gyorsulással szétválasztás céljából. A felülúszó folyadékot eltávolítjuk és a micéliumot egy kísérleti kémcsőbe helyezzük, amelybe Helly-féle rögzítő folyadékot adunk. 24 órás állás után az elválasztott sejteket 10 ml vízzel mossuk, amíg el nem színeződnek. Ezután a sejteket 10 ml IN sósavba tesszük és 60 °C-on melegítjük 15 percig, majd lehűtjük szobahőmérsékletre, 10 ml vízzel mossuk, 2 percre 10 ml 20—50-szeresére hígított salétromsav oldatba mártjuk és 2-3-szor 10 ml vízzel mossuk. A kapott rostos sejteket mikroszkóp üvegre helyezzük, a nedvességet hagyjuk elpárologni, majd a sejtekhez pár csepp Giemsa-oldatot adunk és 15 perces állás után kis vízzel mossuk és szárítjuk. Ha az ilyen módon megfestett sejtmag sejtjét 1000-szeres nagyítású mikroszkóp alatt megvizsgáljuk, minden sejtmag pirosra festett kör alakú foltként jelentkezik. így a sejtmagok számát könnyen meghatározhatjuk a kör alakú piros foltok megszámlálásával a micélium egy sejtjében. A kapott micélium nem savanyította meg a lakmusz tejet és nincs zselatin nedvesítő képessége. A monokarionos micélium szaporítása: A fent leírt módon kapott micéliumot 12 liter 5% glükózt és 0,75% élesztőkivonatot tartalmazó táptalajjal együtt egy 20 literes üveg fermentorba táplálunk (gyártó cég: Kyoritsu Riko Co. Ltd.), majd 2 kg/cm2 gőzt fújunk közvetlenül az üveg fermentorba. A gőz sterilizálás után, amelyet 120 °C-on és 20 percig végzünk, és hűtés után 1 liter monokarionos micéliumot tartalmazó szuszpenziót oltunk be 0,5 gfl sebességgel, 0,5 percenkénti levegőztetési sebességgel és 550 percenkénti fordulatszámmal keverve azonnal tenyésztjük, összehasonlításul teljesen azonos körülmények között tenyésztjük a dikarionos micéliumot, mint a monokarionos micéliumot. Ha a szaporodási sebességeket a monokarionos és dikarionos sebességek esetében úgy vetjük össze, hogy a 8 g/1 micélium koncentráció eléréséhez szükséges időt hasonlítjuk össze, akkor a monokarionos micéliumot negyed annyi idő alatt tenyésztjük, mint a dikarionos micéliumot (lásd: 1. ábra.). Azt is megállapítottuk, hogy a monokarionos micélium szaporodási mértéke a dikarionos micélium szaporodás mértékét 20%-kal felülmúlja. 2. példa A Coriolus versicolor (Fr.) Quél. ferde tenyészetéből kapott micéliumon az 1. példában leírt módon határozzuk meg a sejtmagok számát. Eredményképpen azt találtuk, hogy ahogy a 2. ábra mutatja, valamennyi sejt dikarionos és nem észleltünk egyáltalán monokarionos micéliumot. Az eredeti gombát Coriolus versicolor (Fr.) Quél. CM—KH-nek nevezzük és FERM—P 2412 számon deponáltuk 1973. december 25-én a fent megadott szervezetnél. 100 ml 5% glükózt és 0,75% élesztőkivonatot tartalmazó táptalajt 500 ml-es Erlenmeyer lombikba helyezünk és melegítés közben sterilizáljuk. Ezt a táptalajt ezután a fenti dikarionos micéliummal platinakacs segítségével beoltjuk és 3 napig rázzuk (előtenyésztés) egy helységben, melynek hőmérsékletét 25±5 °C-ra állítjuk be. Pirula alakú micéliumot kapunk. A pirula alakú micéliumot tartalmazó táptalajt homogenizálóban (Sakuma Seisakujo gyártmánya) homogenizáljuk 5 percig, majd nyírásnak vetjük alá, ezáltal a pirula forma lényegében eltűnt. A tenyésztést a fent említett feltételek mellett folytatjuk (fő tenyésztés) és 4 nappal később az előállított pirula formájú micéliumot ismét 5 percig homogenizáljuk, majd nyírásnak vetjük alá. A gombasejtek koncentrációja ennél a fázisnál 11 g/l volt. 1 ml homogenizált micéliumot tartalmazó táptalajt az első tenyésztési menetben alkalmazott folyékony közeghez adjuk, m<ÿd azonos körülmények között második tenyésztési eljárásnak vetjük alá. A tenyésztési periódust azonban kissé megváltoztatjuk, az előtenyésztést 3 napig folytatjuk és a fő tenyésztést szintén 3 napig végezzük. A gomba sejtek koncentrációja lényegében azonos volt, mint az első tenyésztési folyamatban. Hasonlóan végezzük a harmadik tenyésztést is, a gombák sejt koncentrációja az első rázott tenyésztésnél elért koncentrációt éri el, 2 napig előtenyésztjük és 3 napig tart a fő tenyésztés. Has (Kilóképpen végiünk el egy negyedik tenyésztést is 2 napig tartó előtenyésztéssel és 2 napig tartó fő tenyésztéssel 12 gU gombasejt kopcentrációjú táptalajt kapunk, ez a koncentráció nagyobb, mbit az első tenyésztésnél kapott koncentráció. Á kapott micélium nem pirula formájú 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
