175947. lajstromszámú szabadalom • Eljárás daganat-ellenes nitrogén-tartalmú poliszac8aridok előállítására
7 175947 kitermeléssel. A por nedvesség-tartalma 7,5% és analízise a következő eredményt szolgáltatta: C =40,5%, H = 6,2%, N = 5,8%, O =47,5%. A fenti %-os oxigén-tartalmat úgy kaptuk, hogy a többi elem %- os mennyiségének összegét levontuk 100-ból. A kapott por vízben jól oldódik. Azt találtuk, hogy intraperitoneális adagolás esetében egereken Sacroma—180 szilárd daganatokkal szemben mutatott gátló hatása 90% volt, míg ugyanezen az érték 65%-nak adódott orális adagolásnál. A találmány szerinti eljárással előállított termék daganat ellenes hatását a következő, ismert eljárással vizsgáltuk: Sarcoma—180 daganatsejteket ültettünk át egerek hasüregébe és 7 nap elteltével, amikor a sejtek már kellőképpen megnőttek, 106 sejtet átültettünk más egerek hónaljbőre alá, hogy szilárd daganatokat hozzanak létre. A találmány szerinti eljárással előállított anyag adagolását 24 órával az átültetés után kezdtük meg. Intraperitoneális adagolás esetén az anyagot 10mg/kg dózisban, napi egyszeri alkalommal, 20 napon át adagoltuk, 0,2 ml/20 g (egér testsúly) teljes dózisig, és orális adagolásra az anyagokat 1000 mg/kg adagban, napi egyszeri alkalommal 20 napon át adagoltuk, 0,2 ml/20 g (egér testsúly) teljes dózisig. A daganatokat kifejtettük az átültetést követő 25. napon, és meghatároztuk a daganat növekedés gátló arányt (%), megmérve az átlagos daganatsúlyt azokban az egerekben, amelyeket a találmány szerinti eljárással előállított anyaggal kezeltünk, illetve a kontroll állatokban. összehasonlítás kedvéért az extrakciót és a tisztítási eljárást azonos körülmények között 4 liter vízzel is végrehajtottuk a 4 liter 0,1 n nátriumhidroxid-oldat helyett. A kitermelés így 7,8% volt, azaz a találmány szerinti eljárással elérhető kitér mêlés 60%-a. 2. Példa 500 g Coriolus versicolor (Fr.) Quél. (FERM-P No. 2414) élő micéliumot, melynek nedvesség-tartalma: 70,8%, nitrogén-tartalma: 2,6%, a száraz bázisra számítva, hozzáadunk 2 liter vízhez és keverékével 10—20 percen át őriünk, és az elegy - hez fokozatosan hozzáadunk 500 ml 1 n nátrium-hidroxid oldatot. A kapott elegyet forró vízfürdőn, 90-95 °C hőmérsékleten 2 órán át extraháljuk, majd sósav-oldattal semlegesítjük, mossuk és a sejteket az 1. példában leírt eljárással elkülönítjük. A kapott extraktumot ultraszűréssel dolgozzuk fel, Bio-Engjneering Co. gyártmányú, G-05T membránnal felszerelt ultraszűrőt használva, hogy eltávolítsuk az 5000-nél kisebb molekulasúlyú komponenseket. Az elkülönítést koncentrálás és fagyasztással végzett szárítás követi, ami 24,2 g máj-barna por keletkezéséhez vezet. Kitermelés: 15,1%. A por nedvesség-tartalma 7,6%, és nitrogén-tartalma 6,0%, míg víz-oldhatatlan komponenseinek mennyisége megközelítőleg 20%. A visszamaradó rész vízben jól oldódik. Analízis eredmények: C =41,2%, H = 6,1%, N = 6,08%, O =46,7%. A fenti %-os oxigén-tartalmat úgy kaptuk, hogy a többi elem %-os mennyiségeinek összegét levontuk 100-ból. A port feloldjuk és az oldhatatlan maradékot 5c jelű szűrőpapírral eltávolítjuk. Megvizsgáljuk a visszamaradó tiszta oldat Sarcoma-180 szilárd daganatokkal szemben mutatott gátló hatását. Intraperitoneális adagolás esetén a gátló hatás 93%, míg orális adagolásnál 70%. 3. Példa 2 kg Coriolus versicolor (Fr.) Quél. (FERM-P No. 2414) száfaz sejtet, melynek nedvesség-tartalma: 8,0% és nitrogén-tartalma: 2,5%, 20 liter 0,4 n nátriumhidroxid-oldathoz adunk és az elegyet 2 órán át hűtő-fűtő köpennyel ellátott extraháló edényben, keverés közben extraháljuk, miközben a köpeny hőmérsékletét úgy állítjuk be, hogy a belső hőmérséklet 90—95 °C legyen. Az extrahált iszapot lehűtjük szobahőmérsékletre és pH-értéket 2 n sósav-oldattal fokozatosan, keverés közben történő adagolásával 7,0-ra állítjuk be. A maradékot centrifugálással elkülönítjük a folyékony extraktumtól. A maradékot elkeverjük 20 liter 0,4 n nátriumhidroxid-oldattal és 90—95 °C-on, 2 órán át az előzőhöz hasonló módon extraháljuk, hűtjük, semlegesítjük és centrifugáljuk (a sejtek eltávolítása céljából). Elkülönítve, folyékony extraktumot és maradékot kapunk. Az utóbbit ismét az előzővel analóg módon extraháljuk 1 órán át 0,4 n nátriumhidroxid-oldattal. A háromszor ismételt extrakciós eljárással körülbelül 58 liter folyékony extraktumot kapunk. Ezt megközelítőleg 10 liter térfogatra koncentráljuk vákuum bepárlással, majd ultra-szűrésnek vetjük alá. HFA-180 membránt használva, mely az Abcor Inc. terméke. Az ultraszűrést 10 °C-os hőmérsékleten, 2,04 atm nyomáson végezzük az 5000-nél kisebb molekulasúlyú termékek eltávolítása céljából. Ezt követően az oldatot körülbelül 5 liter térfogatra koncentráljuk. A feldolgozás során kapott és az ultraszűrés során elválasztott kis molekulasúlyú frakció 70 literét AS-205 membránt használva (Abcor Inc.) fordított ozmózisos eljárással dolgozzuk fel, hogy eltávolítsuk a kis molekulasúlyú komponenseket. A kapott oldatot ezután körülbelül 5 liter térfogatra koncentráljuk. Az eljárás során használt körülmények a következők: átlagos nyomás: 25—30 kg/cm2, kezelési hőmérséklet körülbelül 10°C. Az ultraszűréssel és fordított ozmózissal kapott oldatokat egyesítjük és az egyesített oldat 10 literét porlasztással szárítjuk. 395 g máj-barna port kapunk 19,9% kitermeléssel. A por nedvesség-tartalma: 7,0% és analízise a következő eredményeket szolgáltatta: C =40,8%, H = 6,0%, N = 4,0%, O =49,2%. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
