175883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új szukcimid-észterek előállítására
9 175883 10 b) Metakriloil-oj-hidroxi-karbonsav-oxi-szukcinimid-észter (d eljárásváltozat) 20 ml kloroformban a metakriloil-co-hidroxi-karbonsav káliumsójának és a hidroxi-szukcinimid metánszulfonátjának ekvivalens mennyiségét, valamint katalitikus mennyiségű 18-korona-6-ot 8 napon át keverjük szobahőmérsékleten. Ezután a kivált metánszulfonsav-káliumsót leszűrjük. A visszamaradó oldatot telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal kirázzuk, szárítjuk és bepároljuk. Nem kristályosodó világossárga olajat kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat szerint (Rf = 0,9) azonos az a) szerint előállított termékkel. Kitermelés: 54%. 5. példa Hidroxi-szukcinimid-N-2-hidroxi-etil-N’,N’-dimetil-karbamid-borostyánkősav-észter 13,2 g N-2-hidroxi-etil-N’,N’-dimetil-karbamidot abszolút tetrahidrofuránban oldunk. Ezután 2,4 g nátriumhidrid-szuszpenziót csepegtetünk hozzá pontosan 5 perc alatt. A hidrogénfejlődés befejeződéséig szobahőmérsékleten keverjük, és 10 g borostyánkősavanhidridet adunk hozzá. További, 24 órás keverés után bepároljuk és vizet adunk hozzá. A hidrogénfejlődés befejeződése után a szerves részt elválasztjuk, az oldatot megsavanyítjuk, és metilén-kloriddal kirázzuk. A szerves fázist megszárítjuk és bepároljuk. Halványsárga színű olaj marad vissza. Kitermelés: az elméleti 53%-a. Ebből a savból a 4. kiviteli példában leírttal analóg módon állítjuk elő a hidroxi-szukcinimid-észtert. Kitermelés: az elméleti 35%-a. Olvadáspont: 97—98 °C. Elementár-analízis: számított: C = 47,5%, H = 5,8%, N = 12,8%, talált: C =47,5%, H = 5,8%, N = 12,8%. Dime til-szül foxi dban kb. 100 °C-on végzett hevítéssel a megfelelő izocianát képződése közben dietilamin hasad le belőle. Alkalmazási példák 6. példa Tripszin stabilizálása különböző szimmetrikus bifunkcionális vegyületekkel végzett térhálósítás útján a) összehasonlító kísérlet A tripszint egy első kísérletben glutáraldehiddel, egy második kísérletben parafasav-bisz(unido-észter)-hidrokloríddal reagáltatunk, és az így térhálósított tripszin aktivitáscsökkenését a szabad tripszinével hasonlítjuk össze. E célból 25-25 ml desztillált vízben levő 50—50 mg tripszinhez a térhálósítószer 0,05 mólos foszfátpufferben (pH = 7,5) oldott 2—2/rmól térhálósítószert adunk, és az elegyet szobahőmérsékleten keverjük. 20 óra múlva mind a szabad, mind a glutáraldehiddel térhálósított tripszin aktivitása a kezdeti aktivitás 15%-ára csökken. 50 óra múlva az aktivitás mind a három próbánál 0-ra csökken. A parafasav-bisz(imido-észter)-hidrokloriddal térhálósított tripszin aktivitása 20 óra múlva még 50%, 50 óra múlva még 30% és 100 óra múlva még 20% volt a kiindulási aktivitás százalékában. A kísérletet a 2. és 3. kiviteli példákban leírt módon előállított észterekkel megismételjük. 20 óra múlva a 3. kiviteli példa szerinti vegyülettel az aktivitás még 85%, a 4. kiviteli példa szerinti vegyülettel pedig még 50%. 50 óra múlva a 2. kiviteli példa szerinti vegyülettel térhálósított tripszin aktivitása még 43%, a 3. kiviteli példa szerinti vegyülettel még 27%. 100 óra múlva a 2. kiviteli példa szerinti vegyülettel térhálósított tripszin aktivitása a kezdeti értéknek még mindig 25%-a. A példa bizonyítja, hogy a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek előnyösebbek, mint az ismert térhálósítószerek. 7. példa Vese-aciláz stabilizálása térhálósítással A vese-aciláz aktivitása 0,1 mólos foszfátpufferben (pH = 4) 4 °C-on végzett hűtés ellenére 3—5 nap alatt 0-ra csökken. Ha azonban az 1. kiviteli példában leírt módon előállított vegyületet vagy parafasav-bisz(hidroxi-szukcinimid-észter)-t adunk hozzá (melyet az 1. kiviteli példában leírttal analóg módon állítunk elő), akkor az aktivitás a kezdeti értéknek csak 70-50%-ára csökken. Ezt a megmaradó aktivitást 2hónapon át ellenőrizzük, és az ezen az időn belül állandó marad. Ezt az eredményt akkor is elérjük, ha a protein észterhez viszonyított mól arányát 1 : 1 és 1 : 8 között változtatjuk. Gutáraldehid alkalmazásával végzett összehasonlító vizsgálatnál nem tapasztalunk stabilizáló hatást. 8. példa Vese-aciláz immobilizálása kopolimerizáció alatt 1000 mg aminoacilázt (liofilizált formában) (fajlagos aktivitás: 17,0 U/mg) 25,0 ml, pH = 8,3, 1 mólos trisz-pufferben oldunk. Hozzáadunk 2,5 ml olyan oldatot, amelyet 30,7 mg metakril-hidroxi-kapronsav-hidroxi-szukdnimid-észterből (4. kiviteli példa) dioxánnal készítünk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
