175838. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a Corynebacterium glutamicum mikroorganizmustörzs szelekciójára
3 175838 4 A találmány szerinti új törzs előnye, hogy lizint termelő képessége lényegesen nagyobb az eddig ismert törzsekénél, és ez a tulajdonsága a lizin-analógokkal szemben mutatott rezisztenciájával és növekedésének homoszerintől való függésével kapcsolódik. A törzset fermentációs tartályban olyan közegben tenyésztettük, amely szacharózt, őrölt földimogyoró savas hidrolizátumát, kukoricát és ásványi sókat tartalmazott. A tenyészetet megfelelő mozgatás és levegőztetés mellett 29 C° hőmérsékleten tartottuk, és a pH-t ammónia hozzáadásával folyamatosan6,8—7,2 értéken tartottuk. Ilyen körülmények között 96 óra tenyésztés után a termelt lizin 600 gramm/liter töménységben halmozódott fel a tenyésztő közegben. Az új Corynebacterium glutamicum CCM 3287 törzs a következő morfológiai, tenyésztési és fiziológiai adatokkal jellemezhető: Gram-pozitív, nem mozgékony, nem spórás, 1,6 x 1,9— 3,5 fxm nagyságú, metakromatikusan szemcsézett, magukban, párokban vagy rendezetlen fürtökben előforduló cocci vagy rövid pálcikák. Hús-pepton tartalmú agaron kerek, sima, fényes felületű, krémszínű, határolt telepek fejlődnek. Hús-pepton tartalmú ferde agaron intenzív fehér növekedés figyelhető meg a teljes agar felületen és nincs elszíneződés. Húslében tenyésztve a törzset zavarosság és üledék figyelhető meg; film nem képződik. Véres agaron kerek, sima, szürke, határolt telepek fejlődnek; hemolízis nem történik. Fizikai tulajdonságok : Optimális hőmérséklet : 27—32 C° Optimális pH-érték : 7,0—7,2 Hővel szembeni ellenállás: 56 C°-on 1 óra, 80 C°-on 10 perc Aerob szervezet. Zselatint nem folyósít el. A lakmuszt elszínteleníti, de nem csapja ki. Glükózt, fruktózt és szacharózt hasznosít. A keményítőt csak kis mértékben hidrolizálja. A cellulózt nem bontja. A nitrátokat nem redukálja. Hidrogén-szulfidot nem képez. Indolt nem képez. Kataláz-próba: pozitív. Metilénkék-próba : negatív. Voges—Proskauer-próba : negatív. 5 10 15 20 25 30 |35 40 45 Növekedéséhez a vitaminok közül biotin, az aminosavak közül pedig homoszerin szükséges. A Corynebacterium glutamicum mikroorganizmus 50 szelektálását a találmány szerint úgy végezzük, hogy a törzset először teljes táptalajon 24 óráig tenyésztjük, majd a sejtszuszpenziót 7,2 pH-értékű foszfát-pufferral mossuk. Mutagén hatás céljából ezután 7,2 pH értékű foszfát-pufferban készült, 0,05 M töménységű etil-metán- 55 szulfonát-oldatban tartjuk a tenyészetet. Ez után a kezelés után a szuszpenziót — előzetesen desztillált vízzel mosva — minimál-táptalajon tartjuk S-(2-aminoetil)-L-cisztein és L-homoszerin hozzáadásával. A keletkezett telepeket hús-pepton tartalmú ferde agaron elválasztjuk. 60 Megvizsgáltuk a tenyészet rezisztenciáját lizin-analóggal szemben, valamint növekedésének homoszerinfüggését és lizint termelő képességét. A találmányt a következő példák világítják meg közelebbről : 65 1. példa A Corynebacterium glutamicum prototrof mikroorganizmust Erlenmeyer-lombikban 750 ml teljes-táptalajba oltottuk. A táptalaj összetétele a következő volt: glükóz kazein-hidrolizátum élesztő-kivonat káliumdihidrogénfoszfát dikálium-hidrogénfoszfát só-oldat alga-agar víz 0,5 gramm 10.0 gramm 5.0 gramm 3.0 gramm 1.0 gramm 1 ml 25.0 gramm 1000 ml (A só-oldatot úgy készítettük, hogy 0,5 gramm vasszulfát-heptahidrátot 100 ml vízben feloldottunk.) A tenyészetet rázógépben (kilengési hossz 9 cm, kilengési frekvencia 91/perc) 28 C°-on 24 óráig tartottuk. Ezután a sejt-szuszpenziót 7,2 pH-értékü foszfát-pufferral mostuk, majd 18 órán keresztül 0,05 M töménységű etil-metánszulfonát-oldattal kezeltük. Ezután a sejtszuszpenziót sterilizált desztillált vízzel mostuk, hígítottuk és tányéron a következő összetételű minimum-táptalajba oltottuk : glükóz nátrium-citrát kálium-dihidrogénfoszfát dikálium-hidrogénfoszfát ammónium-szulfát kristályos magnéziumszulfát só-oldat 0,02 g biotin 100 ml desztillált vízben feloldva agar desztillált víz 1.0 gramm 0,4 gramm 7.0 gramm 2.0 gramm 1.0 gramm 0,1 gramm 1 ml 10 ml 25,0 1000 ml (A só-oldat összetétele megegyezett az 1. példa szerintivel.) A közeget milliliterenként 10 mg S-(2-aminoetil)-L-ciszteinnel és 0,001 mg L-homoszerinnel egészítettük ki. A tányérokat 28 C°-on tartottuk 120 órán keresztül, majd e tenyésztési idő után a lap felületén található telepeket hús-pepton tartalmú ferde agaron elválasztottuk. Az agaron kialakult tenyészeteket megvizsgáltuk a lizin-analóggal szemben mutatott rezisztencia, homoszerinfüggőség és lizint termelő képesség szempontjából. 2. példa A Corynebacterium glutamicum CCM 3287 mikroorganizmus törzs 24 órás tenyészetét 750 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő 60 ml térfogatú táptalajba oltottuk. A táptalaj összetétele a következő volt: szacharóz 25,0 gramm kukorica 30,0 gramm (65% száraz-anyag tartalommal) víz 1000 ml. A táptalaj pH-értéke 7,0 volt, sterilizálás céljából 30 percig 120 C°-on tartottuk. A beoltott táptalajt rázógépen (kilengési hossz 9 cm. 2
