175575. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kanamicin-származékok előállítására
175575 14 10. L-S-Benziloxi-karbonil-amino-a-hidroxi-valeriánsav 400 mg (3,0 millimól) L-S-amino-a-hidroxi-valeriánsav* és 250 mg (6,5 millimól) nátrium-hidroxid 25 ml vízzel készült oldatához 0—5 °C-on félóra alatt becsepegtetünk 580 mg (3,3 millimól) karbobenzoxi-kloridot. Egy órán át 5—15 °C-on keverjük az elegyet, majd 25 ml éterrel mossuk, pH-ját sósavval 2-re állítjuk be, és háromszor 30 ml éterrel kirázzuk. Az egyesített éteres részeket 10 ml telített nátrium-klorid oldattal mossuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson ledesztilláljuk az oldószert. A maradék kristályos anyagot benzolból átkristályosítjuk, és így 631 mg (78%) terméket nyerünk, olvadáspontja: 110— 111 °C, IR-spektrum (KBr) : 3460, 3350, 1725, 1685, 1535,1280, 730, 690 cm“1. NMR-spektrum (aceton-d6): S (ppm): 1,70 (4H, m), 4,14 (2H, q, J=4,5 Hz), 4,19 (1H, m), 4,82 (2H, s), 6,2 (3H, széles), 7,25 (5H, s). [a]o = 1,6° (c=10, metanol). * S. Ohshiro et al. Yakugaku Zasshi, 87, 1184 (1967). Analízis C13H17N05 képletre: számított: C 58,42, H 6,41, N 5,24%, talált: C 58,36, H 6,50, N 5,27%. 11. L-S-Benziloxi-karbonil-amino-a-hidroxi-valeriánsav-N-hidroxi-szukcinimid-észter 535 g (2,0 millimól) L-8-benziloxi-karbonil-amino-a-hidroxi-valeriánsav és 230 mg (2,0 millimól) N-hidroxi-szukcinimid 55 ml etil-acetáttal készült oldatához hűtés és keverés közben hozzáadunk 412 mg (2,0 millimól) N,N'-diciklohexil-karbodiimidet. 3 órán át szobahőmérsékleten keverjük az elegyet, majd a kivált N,N'-diciklohexil-karbamid eltávolítása céljából megszűrjük. Csökkentett nyomáson ledesztilláljuk az oldószert, így 780 g (100%) terméket nyerünk viszkózus szirup formájában. IR (film): vco 1810, 1785, 1725 cm“1. A találmány szerinti eljárást a következőkben, a találmány oltalmi körének szűkítése nélkül, példákkal szemléltetjük. 13 1. példa 6'-Metil-kanamicin A (BB—K 25). A módszer 1. 610 mg lílium-alumínium-hidrid 10 ml száraz dioxánnal készült szuszpenziójához 70 °C-on hozzácsepegtetjük 618 mg 6'-N-karbobenzoxi-kanamicin A (6'-N-Cbz-kanamicin A) 30 ml száraz dioxánnal készült szuszpenzióját. 20 órán át 70 °C-on keverjük az elegyet, majd —5—0 °C-ra hűtjük. Óvatosan kb. 20 ml hideg vizet adunk hozzá, majd 2 normál sósavval semlegesítjük az elegyet, végül csökkentett nyomáson szárazra desztilláljuk. A maradékot bőven mossuk etanollal, így 536 mg nyersterméket nyerünk. Ezt feloldjuk kevés vízben, és egy CG—50 ioncserélő gyantával (NH4+-fázis, 20 ml) töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot először vízzel, majd 1 liter 0,1 normál ammónium-hidroxid-oldattal, utána 600 ml 0,2 normál ammónium-hidroxid-oldattal, végül 500 ml 0,5 normál ammómum-hidroxid-oldattal mossuk át. 10 ml-es frakciókat szedünk, és ezeket ninhidrin volt teszttel, korongos tartalmi meghatározási módszerrel (B. subtilis PCI 219) és szilikagél lemezen, az S—110 jelű futtatóeleggyel (kloroform—metanol—28%-os ammóniumhidroxid— víz 1 : 4 : 2 : 1 arányú elegye) végzett vékonyréteg-kromatográfiával vizsgáljuk. A pozitív ninhidrin tesztet mutató és vékonyrétegen Rf=0,50-nél bioaktív foltot adó frakciókat egyesítjük, és csökkentett nyomáson szárazra desztilláljuk. Ily módon 137 mg (27%) BB—K 25-öt nyerünk, olvadáspont: 183—187 °C (bomlik). NMR-spektrum (D20): 8 (ppm): 2,51 (3H, s, 6'N— —CH2), 4,95 (1H, d, J=4 Hz, 1”—H), 5,01 (1H, d, J=3 Hz, 1'—H). Analízis C19H38N40U.H2C03 képletre: számított : C 42,85, H 7,19, N 9,99%, talált: C 42,97, H 7,27, N 9,63%. 2. 8,8 g lítium-alumínium-hidrid 100 ml száraz dioxánnal készült szuszpenziójához hozzáadjuk 9,0 g 6'-N-Cbz-kanamicin A 200 ml száraz dioxánnal készült szuszpenzióját, majd 4 napon át 80 °C-on keverjük a reakcióelegyet. Utána lehűtjük 10 °C-ra, óvatosan 200 ml vízzel kezeljük, és az oldhatatlan anyagok eltávolítása céljából megszűrjük. 1 normál sósavval semlegesítjük a szűrletet, majd az oldószereket csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Etanollal többször mossuk az elegyet, majd kevés vízben feloldjuk. CG—50 (NH4+-fázis, 200 ml) ioncserélő gyantával töltött oszlopon kromatografáljuk a vizes oldatot. Az oszlopot először 100 ml vízzel mossuk, majd egymás után 2 liter 0,1 normál ammónium-hidroxid-oldattal, majd 1,5 liter 0,2 normál ammónium-hidroxid-oldattal eluáljuk. 20 ml-es eluátum-frakciókat szedünk. Vékonyrétegen (szilikagél lemez, futtatóelegy: kloroform—metanol—28%-os ammóniumhidroxid—víz 1 : 4 : 2 : 1 arányú elegye) a 119—-144. frakció Rf=0,45-nél bioaktív és pozitív ninhidrin-tesztet mutató foltot ad. Ezeket egyesítjük, csökkentett nyomáson ledesztilláljuk róluk az oldószereket, és a maradékot liofilizáljuk, így 1,139 g (16%) az A-(l) módszerrel nyerttel azonos BB—K—25-öt nyerünk. 2. példa 6'-N-Metil-kanamicin A (BB—K 25). B módszer 618 mg (1 millimól) 6'-N-Cbz-kanamicin A 30 ml száraz piridinnel készült szuszpenziójához keverés közben, 70 °C-on 7 ml trimetil-klór-szilánt és 14 ml hexametil-diszilazánt adunk. Éjszakán át ugyanezen a hőmérsékleten kevertetjük az elegyet, majd csökkentett nyomáson ledesztilláljuk az oldószert, és a fölös reagenseket. Száraz tetrahidro-furánnal kezeljük a maradékot, az oldatlan anyagot kiszűrjük, és száraz tetrahidro-furánnal mossuk. Egyesítjük a szűrletet, és a mosófolyadékokat, majd csökkentett nyomáson ledesztilláljuk az oldószert, így 1,567 g trimetil-szílilezett terméket nyerünk. Ezt 30 ml száraz tetrahidro-furánban oldjuk, és 758 mg lítium-alumínium-hidrid 70 ml száraz tetrahidro-furánnal készült szuszpenziójához adjuk az oldatot. 22 órán át kevertetve forraljuk az elegyet. Utána kb. 0 °C-ra hűtjük, és óvatosan 20 ml jeges vízzel kezdjük, és az oldatlan anyagok dtávoUtása céljából megszüljük. 6 normál sósavval semlegesítjük a szürietet, majd csökkentett nyo5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
