175523. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gamma-globulin intravénás elviselhetőségének javítására
3 175523 4 lésére irányuló olyan eljárással oldjuk meg, amelynek során a vérből vagy vér készítményekből kicsapott gamma-globulint makromolekuláris, a globulin molekulákat egymással szemben leárnyékoló és az oldatból kiszorító anyagok, így 'hidroxietilkeményítő, zselatin, dextránok, albumin, polialkoholok, polivinilek jelenlétében újra feloldjuk, ezt követően kicsapjuk és újra, különösen fiziológiás konyhasó-oldatban felvesszük. A hidroxietilkeményítő hatékonysága jelenti mai ismeretünk szerint az optimumot, hasonló hatást érhetünk el azonban a többi, megnevezett anyag hozzáadásával is. A csapadékot előnyösen pufferolt, 3,5—8,0 pH-értékű vizes hidroxietilkeményítő-oldatban újra feloldjuk. Különösen előnyösnek bizonyult 6,5—6,9 pH-érték alkalmazása. A vizes oldat hidroxietilkeményítő-tartalma 1 és 30% közötti lehet, különösen jó eredményeket kapunk 8-10% hidroxietilkeményítő-tartalom esetén. 1000 és 900 000 közötti molekulasúlyú hidroxietilkeményítőt használunk. A gamma-globulin csapadék pufferolt hidroxietilkeményítő-oldatban való ismételt feloldása után az elegyhez 10% polietilénglikolt adunk. Az elegy lecsapódott és le nem csapódott alkotórészeket tartalmaz. Az utóbbiakat polietilénglikollal kicsapjuk, majd centrifugáljuk. Kicsapószerként polietilénglikol helyett egyéb polimerizált többértékű alkoholokat is alkalmazhatunk. Az elegyet centrifugáljuk. A visszamaradó folyadékot 7,0—7,2 oH-értéken 20% polietilénglikollal összekeverjük, és újra centrifugáljuk. Az így kapott csapadékot célszerűen fiziológiás konyhasó-oldatban feloldjuk, és körülbelül 5% fehérje-koncentrációra hozzuk. Sterilre szűrés után az oldat terápiásán alkalmazható. Az egyes eljárás-lepéseket az alábbi példában világítjuk meg közelebbről. Példa Gamma-globulin elválasztása Összegyűjtött plazmából indulunk ki, amelyet 8% etanollal keverünk össze és 7,2 pH-értéken -3 °C-on kicsapunk. Ekkor kicsapódik az I. frakció. A felüluszó folyadékot ezután -5 °C-on és 5,8 pH-értékert 19% etanollal keverjük össze. Ekkor kiválik a II—III. frakció, amelyek gamma-globulinokból állnak. A csapadékot újra feloldjuk és 5 pH-értéken 8% etanollal i\jra kicsapjuk. A visszamaradó felüluszót ezután 25% etanollal 7,2 pH- értéken ismételten kicsapjuk. Az ekkor keletkező csapadék (II. frakció) legalább 90% gamma-globulint tartalmaz. Anti-komplementáló hatás csökkentése A gamma-globulin csapadékot pufferolt, vizes oldatban, 6,7 pH-értéken, körülbelül 6% koncentrációban újra feloldjuk, mimellett a vizes oldathoz körülbelül 10% hidroxietilkeményítőt adunk. A hidroxietilkeményítő lehetővé teszi a már meglevő aggregátumok leválását és egyidejűleg védi a nem aggregálódott gamma-globulinokat. Fiziológiás konyhasó-oldatba való átvitel 10% polietilénglikol hozzáadása után az elegyet centrifugáljuk. A visszamaradó felüluszót 7,2 pH-értéken 20% polietilénglikollal összekeverjük és centrifugáljuk. A kapott csapadékot fiziológiás konyhasó-oldatban 5,2% fehérje-koncentrációra állítjuk be, majd sterilre szűrjük. A kapott termék terápiás célra alkalmas. A csatolt 1. ábra a hidroxietilkeményítő szerkezeti képletét mutatja. A 2. ábra az ismert, illetve a találmány szerinti eljárással előállított különböző gamma-globulinok, illetve normál szérumok immun-elektroforézis-diagrammjait ábrázolja. Az elektroforézis-vizsgálatokat a következőképpen végeztük: Sík üveglapra (tárgylemez) egyenletes vékony agar-réteget vittünk fel, mely dietilbarbiturát-pufferrel 8,0—8,6 pH-értékre pufferoltunk. A tárgylemezt ezután a 2. ábrán látható módon elektródákon keresztül feszültség alá helyeztük. Az agaron SL jelzi a kiindulási pontokat, mindenkor az A felső részen normál humán szérumot vittünk fel, míg a C alsó részen meghatározott és egyforma mennyiségű 5%-os gamma-globulin oldatot, fiziológiás konyhasó-oldatban. A lemezre 180—200 Volt feszültséget kapcsoltunk, majd 30 perc után megszakítottuk. Ezen idő alatt a szérum részei, illetve a gamma-globulín jobbra, míg a többi alkotórészek, főleg az albumin, balra vándorolnak. Ezután a B középvonalat kimetszettük, és meghatározott mennyiségű, nyúlból származó polivalens antiszérummal töltöttük fel. Az agaron vándorló antigén a vér alkotórészeivel érintkezve koagulációt hozott létre. Ezután ismét meghatározott idő elteltével a preparátumot „Amidoschwarz 10 B” indikátorral színeztük, és a nem szineződő alkotórészeket és a nem kötődött színezőanyagot mosással eltávolítottuk. Az a(-d) diagrammok A része gyakorlatilag ugyanazt a humán szérum diagrammot adták. Az alsó, C részek azonban a következő módon tértek el: a) az ábrán Cohn módszerével előállított gamraa-globulin immun-elektroforézis (IEP) — diagrammja látható. A jobboldali bekeretezett folt a gamma-globulin. látható azonban, hogy a gamma-globulin még egy további anyaggal (SÍ) erősen szennyezett, ezért a vizsgált anyag intravénásán nehezen elviselhető. A b) anyagnál a gamma-globulin foltja mellett további két szennyező anyag (S2 és S3) foltja is látható, A kísérleti anyag proteolitikusan előállított gamma-globulin-készítmény. A c) ábra B-propiolaktonnal módosított gamma-globulin IEP-diagrammja. Az ábrán jól látható a gamma-globulin erős foltja, emellett azonban balra szennyezés folt is van, ami feltehetőleg egy albumin-folt. Az a)-c) diagrammok anyagai kereskedelmi készítmények. A d) ábra mutatja a találmány szerinti eljárással előállított készítmény IEP-diagrammját, melyet hidroxietilkenvényítővel készítettünk. Látható, hogy az erős gamma-globulin folt mellett a diagrammon nem található szennyezést jelentő folt, így ez a gamma-globulin intravénásán jól elviselhető. A diagrammokból leolvasható, hogy a találmány szerinti eljárással előállított gamma-globulin tisztasága gyakorlatilag 100%, és teljesen megfelel az eredeti vér-szérum gamma-globulinjának. Ez utóbbi azt jelenti, hogy a molekulák nem módosulnak és nem változnak meg kémiailag. Ezekből a tulajdonságokból következnek a találmány szerinti eljárással előállított gamma-globulin kísérletekben felülvizsgált további előnyös tulajdonságai, azaz az abszolút biztos intravénás elviselhetőség és a szervezet saját védőanyagaival szembeni erősen csökkent antikomplementáló hatás, amely tulajdonságok in vitro vizsgálatokban tisztán kimutathatók voltak. További előny, amelyet tárolási kísérletekben állapítottunk meg, hogy a találmány szerinti eljárással előállított gamma-globulinok stabilitása különösen nagy. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás intravénásán elviselhető gamma-globulinok előállítására vérből, önmagában ismert módszerekkel, előnyösen hűtéses etanolos frakcionálással nyert gamma-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
