175511. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunglobulin kinyerésére
3 175511 4 polietilén-glikollal történő frakcionált lecsapása jóval specifikusabbá tehető, ha a lecsapást 6—9 szénatomos alkánsavak jelenlétében folytatjuk le, ami által többek között. eltávolítható a fibrinogén és lipoprotein szennyezés a termékből. Immunglobulinok kaprilsav segítségével történő elkülönítésével foglalkozik a következő cikk: Rév. Fr. Etud. Chim. Bioi. (1964) 14 (10). Az ott ismertetett eljárás azonban polietilénglikol egyidejű felhasználásáról nem tesz említést, és csak kis mennyiségek esetén, azaz a milliliteres tartományban alkalmazható. A találmány szerinti eljárással egyszerű módon nyerhetünk nagy tisztasági fokú tisztított immunglobulint, nagy termelési hányaddal. Az igy elérhető termelési hányadok legalábbis elérik az eddig ismert, de a fentebb említett szempontokból kevésbé előnyös módszerekkel eddig elért legmagasabb hozamokat. A találmány szerinti eljárásban alkalmazhatók különféle molekulasúlyü, például 2000 és 12 000 közötti, előnyösen 4000 és 6000 közötti molekulasúlyú polietilénglikolok. A találmány szerinti eljárásban felhasználható alkánsav bármely 6—9 szénatomos alkánsav lehet. Előnyös képviselőjük a kaprilsav. További alkalmas alkánsavak példáiként a kapronsav és a nonánsav említhetők. Felhasználhatók az elágazó szénláncú alkánsavak is. Az immunglobulint tartalmazó oldatot előnyösen 1—8 súly% polietilénglikollal, továbbá 0. 1—5 súly% kaprilsavval vagy más 6—9 szénatomos alkánsavval keverjük össze, a lecsapási lépések legalább egyikét pedig a találmány értelmében 4,5 és 5,5 közötti pH-értéken végezzük. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik, megjegyzendő azonban, hogy a találmány köre nincsen ezekre a példákra korlátozva. 1. példa 415 ml humán vérplazmát, amely literenként 10 g immunglobulint tartalmaz, 5,0 pH-értékre állítunk be. Ezután 3000 molekulasúlyú polietilénglikolt adunk hozzá, oly mennyiségben, hogy ennek koncentrációja a közegben 6% legyen, majd az oldatot 45 percig állni hagyjuk. A főként fibrinogénből álló csapadékot centrifugálással elkülönítjük és a folyadékfázis pH-értékét 7,0-re állítjuk. Ehhez azután további 3000 molekulasúlyú polietilénglikolt adunk 12% koncentráció eléréséig, majd az elegyet 45 percig ismét állni hagyjuk. Ezután centrifugáljuk az elegyet és a folyadékfázist, amely az algumint, valamint az alfa- és béta-globulint tartalmazza; eltávolítjuk. A még nem tiszta immunglobulinból álló csapadékot 0,9%-os vizes nátrium-klorid-oldatban oldjuk oly arányban, hogy az oldat protein-koncentrációja 4% körül legyen. Az oldatot „Seitz EK” szűrővel tisztára szűrjük. Az így kapott tiszta oldathoz ezután 5 g kaprilsavat és 30 g 3000 molekulasúlyú polietilénglikolt (mindkét anyagot 1 liter oldatra számítva) adunk, majd a pH-értéket 4,9-re állítjuk. Ezt az elegyet 2 óra hosszat hagyjuk állni 20 °C hőmérsékleten, majd centrifugáljuk és a folyadékfázist tisztára szűrjük. A tiszta szűrlet pH-értékét 7,0-re állítjuk és 3000 molekulasúlyú polietilénglikolt adunk hozzá oly mennyiségben, hogy a polietilénglikol koncentrációja ismét 12% legyen. Ennek hatására tiszta immunglobulin válik le, ezt centrifugálással elkülönítjük és megszárítjuk. A kapott termék hozama 60%. Tisztasági foka (5% poliakril-amiddal meghatározva) igen nagy, csupán a G-immunglobulinnak és M-immunblobulinnak megfelelő két sáv mutatkozik. (Az analízist 500 meg termékkel végeztük.) A Grabar-William-féle immun-elektroforézissel vizsgálva, nyúl-antitesteket alkalmazva teljes humán szérum-proteinnel szemben, lényegileg csak három ívet találunk, amelyek a G-immunglobulinnak, M-immunglobulinnak, illetőleg A-immunglobulinnak felelnek meg. Az így kapott nagy tisztaságú terméket kívánt esetben intravénás injekció útján beadható készítménnyé alakítjuk oly módon, hogy a tisztított terméket 0,9%-os vizes nátrium-klorid-oldatban oldjuk, oly mennyiségi arányban, hogy az oldat körülbelül 5% proteint tartalmazzon. Az így kapott készítmény különösen előnyös tulajdonsága, hogy antikomplementer-aktivitása rendkívül alacsony és így ez a készítmény kiválóan alkalmas intravénás beadás céljaira. 2. példa Az 1. példában leírt módon dolgozunk, azzal az eltéréssel, hogy humán vérplazma helyett sertés-vérplazmát alkalmazunk. Az 1. példában ismertetettel egyező kiváló tulajdonságokat mutató terméket kapunk. 3. példa Az 1. példában leírt módon dolgozunk, azzal az eltéréssel, hogy humán vérplazma helyett vérszérumot alkalmazunk. Ily módon is az 1. példában megadotthoz hasonló nagy tisztaságú, alacsony antikomplementer-aktivitású terméket kapunk. 4. példa 100 liter plazmához vagy szérumhoz 100 liter 600 g/liter koncentrációjú polietilén-gükol-oldatot (molekulasúly: 3000) adunk. Az elegy pH-értékét 6,5-re állítjuk. A képződött csapadékot centrifugálással elkülönítjük és 100 liter desztillált vízben, amely 0,015 mól/liter nátrium-kloridot tartalmaz, újból feloldjuk. Az oldathoz literenként 40 g 3000 molekulasúlyú polietilénglikolt és 5 g akrilsavat adunk. Az elegy pH-értékét 5,0-ra állítjuk és az elegyet 45 percig állni hagyjuk. A képződött csapadékot centrifugálással elkülönítjük. A centrifugált oldathoz további 40 g/liter 3000 molekulasúlyú polietilénglikolt adunk és a pH-értéket 7,5-re állítjuk 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
