175489. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vakcinák előállítására
5 175489 6 gyen. Ezenkívül a gélkromatográfia megteremti a vírust tartalmazó anyagnak a soron következő művelet, azaz a betöményítés sikeres elvégzéséhez szükséges feltételeit. A vírust tartalmazó anyag betöményítését adszorpció-elúció segítségével végezzük. Az adszorpció-elúciót célszerűen porózus szilikátanyagot tartalmazó oszlopban végezzük. A porózus szilikátanyag lehetővé teszi a szorpciós-felület széles tartományban való változtatását. Porózus szilikatanyagként célszerűen nátrium-boroszilikátüveget vagy nagypórusú, 0,1-0,3 mm szemcse méretű, 300—2000 Â pórusátmérőjű és 0,3—2,5 cm3/g porozitású kovasavgélt alkalmazunk. A szorpciót a vírustól függően teljes telítettségig végezzük. A vírus eluálását a szorbensben 6—10,0 pH-jú és 0,1-1,0 ionerősségű pufferoldat felhasználásával végezzük. Pufferoldatként célszerűen 6-8,2 pH-jú foszfátpuffért, vagy 7,2—10,0 pH-jú és 0,1 —1,0 ionerősségű triszpuffert alkalmazunk. Ezután a vírusszuszpenziót izoláljuk. Célszerűen a tisztított vírusszuszpenziót fiziológiás körülmények mellett izoláljuk. A folyamatot előnyösen gélkromatográfia útján, valamely szilikátanyaggal töltött oszlopon végezzük. Továbbá, a találmány szerint lehetőség van arra is, hogy a meghatározott vírus felhasználásával készített vakcinát úgy állítsuk elő, hogy először a vírust tartalmazó tenyészetet betöményítjuk, majd tisztítjuk és végül a tisztított vírusszuszpenziót izoláljuk, vagy egy műveleti lépést alkalmazunk, melynek során a kiindulási vírusszuszpenziót gélkromatográfiának vetjük alá. Elölt vírusokat tartalmazó vakcinák előállításához a tisztított és betöményített, élő vírusokat tartalmazó vírusszuszpenziókat 5000—200 000 erg/cm2 dózisban UV-sugarakkal besugározzuk vagy 5%-os formalinoldattal kezeljük. A találmány szerinti eljárás többek között abban különbözik az ismert eljárásoktól, hogy technológiai szempontból egyszerű és ennél fogva egyszerű operatív felkészültséget feltételez. Mechanikailag szilárd szilikátanyagok felhasználásával, melyek tulajdonságaikat a sterilizálás alatt nem vesztik el, nem duzzadnak meg, lehetőség nyílik a folyamat során nagy sebességek alkalmazására. A felhasznált sziükátanyagon kizárt a baktériumok növekedése, ezek az anyagok könnyen regenerálhatok és többször alkalmazhatók. Mivel pórusméretük tág határok között változtatható, a gélkromatográfián alapuló folyamatok nagy hatásfokkal végezhetők el. Másrészt az anyagok szorpciós-kapacitása is lehetővé teszi, hogy a vírusszuszpenzió betöményítési foka nagy legyen. A gélkromatográfiás tisztítás és a vírusok szorpció útján való betöményítése által lehetőség nyílik nagyhatású vakcinák előállítására, amelyek a szervezetben nem idéznek elő mellékreakciókat. Az elölt vakcinák előállítása során az UV-sugárral való kezelés lehetővé teszi, hogy az immunogén vírus tulajdonságok ne károsodjanak az inaktiválás alatt. A találmány szerinti eljárás során gyakorlatilag bármilyen ismert vírustörzs tenyészetéből történő vakcinaelőállításra lehetőség nyílik. Néhány vírustörzset például az alábbi helyeken írtak le: Influenzavírus A2 (Honkong) 68: Informationsblatt B03 41, 432-437 (1969), Influenzavírus B (Honkong) 5/772: British Journal of Medicine, 4, 127-131 (1973), Összehasonlítottuk a találmány szerinti eljárással előállított Aj Honkong/68 influenzavírus-vakcina jellemzőit az 1 951 800 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli közrebocsátási irat eljárásával kapott vakcina jellemzőivel. Azt tapasztaltuk, hogy az ismert eljárásnál a kiindulási vírusszuszpenzió 1,0 mg/ml fehérjetartalma (amely a mellékhatásokért felelős) 0,06 mg/ml-re csökkent ugyan, azonban a kezdeti 1 :512 vírusaktivitás is csökkent 1 :256 értékre, azaz a felére. A találmány szerinti eljárásnál a fehérjetartalom 1 mg/ml-ről 0,04 mg/ml-re csökkent, egyidejűleg azonban a vírusaktivitás 1 :512-ről 1 :2048-ra, azaz négyszeresre növekedett. Az ismert eljárással kapott vakcina tisztasága 88%, míg e találmány szerinti eljárással nyert vakcináé 99%. Emellett a találmány szerinti vakcina vírusaktivitása nyolcszorosa az ismert eljárással kapott vakcináénak. A találmányt a következő példákkal szemléltetjük: 1. példa Aj Honkong/68 influenzavírus allantoisz-tenyészetéből 840 ml-t 3 cm átmérőjű, 32 cm magas, és nátriumboroszilikátüveggel töltött oszlopon 0,3- —0,6 cm/perc sebességgel átengedünk. Az allantoisz-tenyészet literje 320 RHA-egység. (A vírustiter az a legnagyobb vírusszaporulat, amely még rendelkezik azzal a képességgel, hogy az eritrocitákat megköti. A nátrium-boroszilikát-üveg szemcsemérete 0,1—0,3 mm pórusátmérőjű 500 Â. A szennyeződéseket és a víruseluátumot trisz-pufferrel lépcsőzetesen távolítjuk el, mimellett a r triszpuffert pirogénmentes vizzel (0,005—0,05 mól, ionerősség 0,1 —1,0) készítjük el. Víruseluátumként a 740- —770 ml közötti frakciót fogjuk fel. A víruseluátum 30 ml-e, melynek titere 10000 RHA-egység, 50—100% vírust tartalmaz. A kapott eluátum tisztítását, izolálását és átalakítását fiziológiás körülmények mellett 3 cm átmérőjű és 50 cm magasságú oszlopon végezzük, melynek töltete 0,16—0,25 szemcse méretű, 450 Â szemcseátmérőjű és 1,3 cm3 /g porozitású szilikagél. A vírust tartalmazó anyagot foszfátpufferrel (0,02 mól, pH =7,4-7,5, nátriumklorid-koncentráció 0,85%) 0,5 cm/perc sebességgel eluáljuk. A 100—200 ml közötti frakciót fogjuk fel. Körülbelül 100 ml vírusszuszpenziót kapunk, amely legalább 50% kiindulási vírust tartalmaz. Az 1. táblázat a kiindulási anyag és a kapott, tisztított vírusszuszpenzió tulajdonságait tartalmazza. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
