175474. lajstromszámú szabadalom • Új eljárás 12ß-hidroxil-csoportot tartalmazó kardenolid vegyületek előállítására mikrobiológiai úton
3 175474 4 rövidek, kb. 50%-ban kacs, 50%-ban laza vagy kompakt, 2-3 kanyarulatból álló spirálok. A spórák sima falúak, ellipszoid alakúak, 0,95-1,00 x 1,10—1,28 p méretűek. Szacharóz-nitrát agaron a telepek csak elszórtan növekednek, a légmicélium krémszínű, a táptalajmicélium világos fahéjszínű, oldható pigment nem keletkezik. Tirozin agaron nem nő. Táp agaron a törzs közepes sebességgel növekedik. Légmicélium nem fejlődik, a táptalaj-micélium színtelen, viaszos felszínű, oldható pigment nem keletkezik. Glükóz-aszparagin agaron a törzs igen gyorsan nő, a légmicélium poros felszínű, pókhálószerűen fut, drapp színű, a táptalajmicélium szintén drapp, oldható pigment nem keletkezik. Bouillon agaron a telepek gyorsan növekednek. Légmicélium nem keletkezik, a táptalajmicélium igen vékony rétegű, nyálkás, oldható pigment nem diffundál az agarba. Burgonya-glükóz agaron a telepek gyorsan növekednek. A légmicélium kezdetben fehér, majd fahéjszínű, végül drapp. A táptalajmicélium fahéj-drapp színű, oldható pigment nem keletkezik. Sabouraud-glükóz agaron a törzs közepes sebességgel növekedik, légmicélium csak lassan és gyéren alakul ki, fehér színű, a táptalajmicélium krém színű, oldható pigment nincs. Löffler-féle alvasztott savótáptalajon a telepek jól növekednek, légmicélium nincs, a táptalajmicélium viaszos, baktériumtelep-szerű, oldható pigment nincs, a proteolítikus hatás egészen minimális. Cellulóz mint egyetlen szénforrás: jól növekedik. Zselatin folyósítás: pozitív. Burgonyaszeleten: a növekedés gyors, a légmicélium fahéj-drapp, oldható pigment nem keletkezik. Véres agaron a telepek szürkésbarnák, viaszosak, 1 mm átmérőjűek, 26 °C-on egy hétig tartó inkubálás után nem spóráznak, gyenge béta-hemolízis észlelhető. Szénforrás asszimiláció D- glükóz + Melezitóz gyenge D-galaktóz + Oldható keményítő + szacharóz — D-xilóz ++ maltóz ++ L-arabinóz * laktóz •ML-ramnóz — raffinózgal aktitszorbóz-N-mannit + cellobióz + inozit trehalóz 4-f szalicin e melibióz a-metil-D-glükozid: gyenge ® táp-agarban jól diffundáló barna pigment + az asszimiláció foka A találmány tárgya új eljárás az I általános képletű kardenolid vegyületek — ahol R jelentése hidrogénatom vagy III általános képletű csoport, ahol Rt jelentése hidrogénatom vagy acetil-csoport, X jelentése pedig hidrogénatom vagy hidroxil-csoport - előállítására mikrobiológiai úton, amely abban áll, hogy valamely II általános képletű szívglükozidot - ahol R és X jelentése a fenti - Streptomyces praecox törzs (MNG 127) süllyesztett, levegőztetett és kevert tenyészetével vizes közegben érintkeztetünk, és a képződött hidroxilezett biológiailag aktív terméket a reakcióelegyből ismert módon elkülönítjük. A találmány szerinti eljárás gyakorlati végrehajtása érdekében a Streptomyces praecox törzset vagy annak variánsait a sugárgombák tenyésztéséhez előnyösen alkalmazható táptalajalkatrészeket használva tenyészthetjük. így energiaforrásként előnyösen glükózt, maltózt, galaktózt, laktózt, keményítőt, dextrint használhatunk. Nitrogénforrás lehet természetes eredetű szerves anyag, mint kazein-hidrolizátum, szójaliszt, földimogyoróliszt, kukoricalekvár, pepton, élesztőkivonat, vagy szintetikus termék, mint aminosavak, karbamid- és ammóniumsók. A táptalajalkatrészek különböző kombinációkban használhatók fel élszerű a táptalajhoz szervetlen sót adni, ebusorban foszfátot, káliumot, kálciumot, magnéziumot vagy vasat. A táptalajban a szénforrás és nitrogénforrás mennyisége és aránya széles határok között változtatható (0,5—4%). A fermentlé savanyodását a táptalajhoz adott kalciumkarbonáttal akadályozhatjuk meg. A fermentáció 20 és 40 °C között különböző hőmérsékleteken, előnyösen a sugárgombák számára kedvező 28—30°C-on hajtható végre. A tenyésztés rázott Erlenmeyer-lombikban, vagy keverővei ellátott fermentorban végezhető. A tenyészet levegőellátását intenzív rázással, vagy süllyesztett tenyészetben levegő-átfúvással kell biztosítani. A tenyészetet többször átoltva friss táptalajra, a hidroxilező aktivitás fokozható. A szubsztrátum a kinőtt tenyészethez vagy az intenzív növekedési fázis alatt adagolható, de hasonló eredményt érünk el, ha a táptalajba tesszük a növekedés megindulása előtt, mert a szívglükozidok jelenléte nem befolyásolja a tenyészet növekedését. Eljárhatunk úgy is, hogy a kinőtt tenyészetet szűréssel elválasztjuk a táptalajtól, pufferben szuszpendáljuk, és az így kapott szuszpenzióhoz adagoljuk a szubsztrátumot. A hidroxilezési reakció szempontjábó.1 fontos a reakcióelegy oxigénellátottságának és a megfelelő hőmérsékletnek a biztosítása. Szubsztrátumként adagolható bármely II általános képletű 12-dezoxi-szívglükozid, vagy maga az aglükon, így az a-acetildigitoxin, a digitoxin és a digitoxigenin. A szubsztrátumként adott vegyületet vízzel elegyedő szerves oldószerben, így etanolban vagy metanolban oldva célszerű a fermentlébe juttatni, de jó eredménnyel végezhetjük a reakciót a finoman porított vegyület vizes szuszpenziójával is. A fermentációs eljárás során előállított I általános képletű, 120-helyzetben hidroxil-csoportot tartalmazó termékeket vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, előnyösen kloroformmal, metilénkloriddal vagy etilacetáttal extrahálhatjuk. A szerves oldószeres oldat betöményítése és a maradék kromatografálása után a kapott nyers terméket átkristályosítással tisztíthatjuk. A találmány legfőbb előnye, hogy lehetőséget teremt gyógyászatilag hatásos szívglükozidok gazda-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
