175295. lajstromszámú szabadalom • Elkárás enzimek, enzim inhibotorok és antitestek immobilizálására vagy stabilizálására
3 175295 4 ció pH-ja az alkalmazott fehéijétől függően változik, azonban előnyösen pH 7,5 körüli érték. Az eljáráshoz bármilyen reakciókörülmény alkalmazható, amelynél a fehérje nem denaturálódik, vagyis a reakció végén a nem reagált anyagot eredeti állapotában lehet eltávolítani, néhány esetben az eljáráshoz bizonyos mértékben szennyezett fehérje is felhasználható. A találmány szerinti eljárás értelmében előzőleg kinonnal kezelt nagy molekulasúlyú anyagot használunk. A mátrix és a kínon közötti reakció 0 °C és 150 °C közötti hőfoktartományban, előnyösen 20 °C körüli hőmérsékleten megy végbe. Az inkubáció ideje a mátrix típusától függően, előnyösen általában 0,5 óra és 100 óra között változik, míg a reakciónál alkalmazott pH 1 és 11 közötti érték, előnyösen pH 7,5 körüli érték. Az aktiválandó mátrix különböző típusú reaktív csoportokat tartalmazhat. A reakció vizes vagy nem vizes közegben egyaránt lefolytatható, mely az alkalmazott kinonnal és a polimer típusával összeegyeztethető. Amint a mátrixot aktiváltuk, a reakciót fehérjével az előbbiekben megadott módon lefolytatjuk. Ezen túlmenően azt találtuk, hogy a cellulózhoz vagy agaróz-gélhez kötött kinonok elősegíthetik a fehérjemolekulák kölcsönös térhálósodását, vagy az intramolekuláris térháló képzéséből eredő fehérjekonformáció stabilizálódását. A térhálósodás mértéke úgy állítható be, hogy a natív fehérjénél nagyobb molekulasúlyú, vízoldható fehérje-származékot kapunk, és olyan fehérje-származékot is előállíthatunk, amely annyira térhálósított, hogy vízben oldhatatlan. A találmány szerinti eljárást a következőkben a példák kapcsán szemléltetjük, azonban nem korlátozzuk azt a példákra. A példákban említett szefaróz a Swedish Company Pharmacia Fine Chemical terméke, mely gömb alakú részecskéket tartalmazó agaróz gél. 1. példa Tripszin immobilizálása 4H—AH szefarózon 1,4-benzokinonnal 1 g 4B-AH szefarózt 20 ml 0,5 M nátrium-klorid vizes oldatában szuszpendálunk és egy éjjelen át állni hagyjuk. A >züozpenziót ezután egy oszlopra (0,9x15 cm) öntjük, és az anyagot 100 ml előbbi oldattal, majd 50 ml 0,05 M nátrium-foszfát-pufferrel pH = 7,4 eléréséig mossuk. A visszamaradt anyagot (4 ml/25 ml pufferoldatban elszuszpendáljuk, és 2 ml 0,1 M 1,4-benzokinon vizes oldatot adunk hozzá, az oldatot frissen készítjük. Az elegyet 24 óra hosszat szobahőmérsékleten, fénytől elzárt lombikban keverjük, majd egy oszlopra (0,9x15 cm) öntjük, és az anyagot 100 ml pufferoldattal mossuk. Az így kapott aktivált szilárd hordozóanyag sötétbarna színű. Ezt az anyagot 25 ml előbbi pufferoldatban elkeverjük, lehűtjük, és ezután a szuszpenzióhoz 5 ml hideg vázben ( 10 mg/ml) kristályos tripszint (British Drug Houses Ltd. Laboratory Chemicals Division, of Poole, England) adunk. Az elegyet 24 óra hosszat 2 °C hőmérsékleten tartjuk, ezután újból egy oszlopra (0,9 x 15 cm) öntjük, és a szilárd anyagot 15 nú-es frakciókban váltakozva pH = 7,4, illetve pH = 4,4 értékű 0,05 M nátrium-foszfát-pufferrel ismét mossuk, összes térfogat 150 ml. Az eljárással egy olyan 4B—AH szefarózra felvitt tripszint kapunk, mely az anyag milliliteréként 35 egység észterázaktivitást mutat [az észterázaktivitást N-alfa-benzoil-arginin-etil-észterrel (BAEE) 25 °C hőmérsékleten és pH = 8,0 értéken L. Goldstein, Methods in Enzymology, 19, 935-962 (1970) módszere szerint határozzuk meg]. Ezen immobilizált tripszin mintáját 4 °C hőmérsékleten 1 M nátrium-klorid vizes oldatban és 0,5 M mono-nátrium-foszfát oldatban (pH = 4,4) tárolva és a felső folyadékfázist időnként kiegészítve, a kezdeti észterázaktivitás három hónap után is változatlanul megmarad. A kinonnal nem kezelt 4B-AH szefaróz mintája, melyet azonban azonos mennyiségű tripszinnel azonos ideig kezeltünk és ezt követően mostunk, enzim-aktivitást nem mutat, ami azt jelenti, hogy a hordozóanyagon az enzim fizikai adszorpciója nem megy végbe. 2. példa Tripszin immobilizálása 4B szefarózon 1,4-benzokinonnal 4 ml 4B szefaróz (Pharmacia Fine Chemicals AB) mintát az 1. példa eljárása szerint mosunk, az anyagot 25 ml 0,05 M nátrium-foszfát pufferben 7,4 pH-n szuszpendáljuk, melyhez frissen elkészített 2 ml 0,1 M vizes 1,4-benzokinon oldatot adunk. Az elegyet fénytől elzárt lombikban szobahőmérsékleten, 20 óra hosszat keverjük. Az így kapott sötétbarna szilárd anyagot mossuk, tripszinnel reagáltatjuk, majd az 1. példában megadott módon ismét mossuk. Ezzel a művelettel egy tripszintartalmú 4B szefarózt kapunk, mely az anyag milliliteréként 26 egység észterázaktivitást mutat. Ez az anyag, az 1. példában megadott azonos körülmények között, három hónapi tárolás után is a kezdeti észterázaktivitás 95%-át megtartja. Ezzel szemben, a kinonnal nem kezelt hordozóanyag mintája, melyet azonban azonos mennyiségű enzimmel kezeltünk és mostunk, enzimaktivitást nem mutat. 3. példa Tripszin immobilizálása 4B szefarózon 1,4-benzokinonnal 4 ml 4B szefaróz mintát az 1. példában megadott módon mosunk, 25 ml 0,05 M nátrium-foszfát pufferben 10 pH-án szuszpendálunk és frissen 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
