175264. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tienamicin elkülönítésére és tisztítására
15 175264 16 la tartalmát 0,3 ml steril Davis-sókompozícióban (0,5 g nátriumcitrát, 7,0 g dikálium-hidrogénfoszfát, 3,0 g kálium-dihidrogénfoszfát, 1,0 g ammóniumszulfát, 0,1 g magnéziumszulfát-heptahidrát, desztillált víz ad 1000 ml) szuszpendáljuk. Az így kapott szuszpenzió 0,2 ml-es részleteivel egy-egy, alábbi összetételű agaros közeget („A” táptalaj + agar) oltunk be: Az „A” táptalaj összetétele: Ardamine (élesztő-autolizátum, a Yeast Products Co. gyártmánya) 10,0 g foszfátpuffer-oldat 2,0 ml glükóz 10,0 g magnéziumszulfát-heptahidrát 0,05 g desztillált víz ad 1000 ml (nátriumhidroxiddal pH = 6,5-re semlegesítve) A foszfátpuffer-oldat összetétele: kálium-dihidrogénfoszfát 91,0 g dinátrium-hidrogénfoszfát 95,0 g desztillált víz ad 1000 ml Az „A” táptalajhoz 25,0 g/liter agart adunk. A beoltott ferde tenyészeteket 8 napig 28 °C-on inkubáljuk, majd 4 °C-on tároljuk. 3 db 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba 50-50 ml „A” táptalajt töltünk, és a lombikokat a fenti módon kapott ferde tenyészetek egyikéből elkülönített spórákkal és légmicéliumokkal oltjuk be. A lombikokat bedugaszoljuk, és 1 napon át rázógépen (fordulatszám: 220/perc, lökethossz: 5,08 cm) inkubáljuk 28 °C-on. Ezután a lombikok tartalmát aszeptikus körülmények között egyesítjük. 20 db 2000 ml-es Erlenmeyer-lombikba 250—250 ml „C” táptalajt töltünk, és a lombiko kát 7—7 ml, a fenti lépésben kapott szuszpenzióval oltjuk be. A „C” táptalaj összetétele: kukoricaliszt 20,0 g oldható cefre (gyártja a Brown Forman Distillers Company, Louisville Kentucky) io,0 g szójaliszt ls’o g kalciumklorid-dihidrát 0,5 g magnéziumszulfát-heptahidrát 0,1 g kobaltklorid-hexadekahidrát Qf0i g vas(II)-szulfát heptahidrát q,01 g kalciumkarbonát 40 g Polyglycol 2000 (a Dow Chemical Co. gyártmánya) o,25 térf.% desztillált víz ad 10 000 ml (nátriumhidroxiddal pH = 6,5-re semlegesítve) A lombikokat 72 órán át 28 °C-on, rázógépen (fordulatszám: 220/perc lökethossz: 5,08 cm) inkubáljuk. A fermentleveket egyesítjük, és a fermentlé mintáját centrifugáljuk. A felső folyadékfázist biológiai elemzésnek vetjük alá, a gátló zóna átmérője az elemzés szerint 43 mm. A fermentlé pH-ja 7,4. A fermentlevet szűqük, a szűrletet híg, vizes sósavoldattal pH = 4,0 értékre savanyítjuk, majd 3000 ml így kapott oldatot 30 ml/perc sebességgel egy, 300 ml Dowex 50 x 2 gyantával (nátrium-forma) töltött oszlopon bocsátjuk át. A gyantaoszlopot 300 ml ionmentes vízzel mossuk, és 2%-os, vizes piridin-oldattal eluáljuk. 8 db, egyenként 150 ml térfogatú eluátumfrakciót fogunk fel, és a frakciókat pH = 7,0 értékre semlegesítjük. A 2. és 3. frakciót egyesítjük, az egyesített, összesen 300 ml térfogatú eluátum biológiai aktivitása az eredeti össz-aktivitás 48%-ának felel meg. Az egyesített frakciók 280 ml-es részletét 40 ml Dowex 1x2 gyantával (klorid-forma) töltött oszlopon bocsátjuk át, és a gyantaoszlopot 160 ml ionmentes vízzel mossuk. Az effluenst és a mosófolyadékot egyesítjük, a kapott, 440 ml térfogatú oldatot híg, vizes nátriumhidroxid-oldattal pH = 8,2 értékre lúgosítjuk, majd csökkentett nyomáson 300 ml végtérfogatra bepároljuk. A koncentrátumot híg, vizes sósavoldattal pH = 7,0 értékre semlegesítjük, és fagyasztva szárítjuk. A fenti lépésben kapott 189 mg szilárd anyagot 25 ml 1 :99 arányú n-butanol/víz elegyben oldjuk, és az oldatot 200—400 mesh szemcseméretű, előzetesen n-butanol/víz eleggyel egyensúlyba hozott Bio—Gel P—2 géllel töltött, 5 x 108 cm méretű oszlopon bocsátjuk át. A gélt 6,7 ml/perc sebességgel n-butanol/víz eleggyel eluáljuk. 500 ml előfrakciót elöntünk, majd az eluátumot 20 ml-es frakciókba fogjuk fel. Az egyes frakciók biológiai aktivitását 1 :25 hígításban vizsgáljuk. E vizsgálat szerint az antibiotikumot a 37-42. frakció tartalmazza, a maximális antibiotikum-koncentráció a 39. frakcióban jelentkezik. A 38—41. frakciót egyesítjük, a kapott, 80 ml térfogatú oldatot 10 ml végtérfogatra betöményítjük, a koncentrátumot pH = 7,0 értékre semlegesítjük, és fagyasztva szárítjuk. 13,5 mg szilárd anyagot kapunk, amelynek aktivitása 6,2-szerese a gélszűrésben felhasznált kiindulási anyag aktivitásának. 4. példa Streptomyces cattleya NRRL 8057 liofilizált tenyészetét tartalmazó, leforrasztott ampullát aszeptikus körülmények között felnyitunk, és az ampulla tartalmát 0,8 ml steril Davis-sókompozícióban (0,5 g nátriumcitrát, 7,0 g dikálium-hidrogénfoszfát, 3,0 g kálium-dihidrogénfoszfát, 1,0 g ammoniumszulfát, 0,1 g magnéziumszulfát-heptahidrát, desztillált víz ad 1000 ml) szuszpendáljuk. Az így kapott szuszpenzió 0,2 ml-es részleteivel egy-egy, alábbi összetételű agaros közeget („A” táptalaj + agar) oltunk be: Az „A” táptalaj összetétele: Ardamine (élesztő-autolizátum, a Yeast Products Co. gyártmánya) 10,0 g foszfátpuffer-oldat 2,0 ml glükóz 10,0 g magnéziumszulfát-heptahidrát 0,05 g desztillált víz ad 1000 ml (nátriumhidroxiddal pH = 6,5-re semlegesítve) s 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
