175158. lajstromszámú szabadalom • Eljárás naftacénszármazékok előállítására
49 175158 50 kukoricalekvár (50% szárazanyag-tartalom) 2400 g, nádcukor 3600 g, ammóniumszulfát 240 g, kalciumkarbonát 900 g, csapvízzel feltöltve 110 literre. A 6,0 pH-jú folyékony táptalajt 122°-os vízgőzzel 40 percig átbuborékoltatással sterilizáljuk. Mivel a sterilizálás folyamán vízgőz kondenzál, lehűlés után a folyékony táptalaj térfogata 120 liter, pH-ja 6,65. Erlenmeyer-lombikban keveréssel kapott 250 ml Streptomyces atroviolaceus DS 8938 törzs tenyészetével oltjuk be, majd keverés és steril levegővel való levegőztetés közben 33 óra hosszat 36°-on inkubáljuk, ekkor a fermentlé alkalmas a tenyésztő termelés beoltására. A termelő tenyésztést 800 literes fermentálóban hajtjuk végre, ez a következő anyagokat tartalmazza: szójaliszt 22 kg, oldható szeszlepárlási maradék 2,750 kg, részlegesen hidrolizált keményítő 16,500 kg, szójaolaj 2,750 liter, nátriumklorid 5,550 kg, csapvízzel kiegészítve 510 literre. A táptalaj pH-ját 500 ml 10 n nátriumkarbonát-oldattal 7,5-re állítjuk be, majd 122°-os vízgőzt 40 percig rajta átbuborékoltatva, sterilizáljuk. Mivel a sterilizálás folyamán vízgőz kondenzál, lehűlés után a folyékony táptalaj térfogata 550 liter, pH-ja ekkor 6,60. A fenti 170 literes fermentálóban levő 55 liter beoltó-tenyészettel beoltjuk, és a fermentlét 26°-on, percenként 205 fordulatú turbinával keverve és óránként 15 m3 steril levegővel levegőztetve, 117 óra hosszat tenyésztjük. A tenyésztés végén a pH 7,60. E — Extrahálás A fent leírt módon kapott 560 liter fermentléhez 28 kg oxálsavat adunk, majd 1 óra hosszat 40°-on keverjük. Miután 25 kg szűrést elősegítő anyagot adunk hozzá, a megsavanyított f-ermentlét szűrőprésen szűréssel elválasztjuk. A micélium szűrőlepényt 3 kg oxálsavat tartalmazó 120 liter, 50°-os vízzel mossuk. A szüredéket és a mosófolyadékot egyesítjük, a kapott 1 pH-jú keveréket 10°-on hűtjük és 50 liter, 6 n nátriumkarbonát-oldat hozzáadásával a pH-t 4,5-re állítjuk be. Az ebben az oldatban levő antibiotikumot 25 liter savas alakban levő Amberlite IRC 50 gyantát tartalmazó oszlopon adszorbeáljuk. A gyantát fokozatosan vízzel addig mossuk, amíg a kifolyó folyadék színtelenné nem válik, ezután 100 liter 50:50 térfogatarányú metanol-víz eleggyel mossuk. Végül az antibiotikumot 250 liter 1 súly/térfogatszázalék nátriumkloridot tartalmazó, 90 : 10 térfogatarányú metanol-víz eleggyel eluáljuk. Ezt az eluátumot 40°-on, 5 -10 Torr nyomáson 20 literre bepakoljuk. A bepárlási maradék pH-ját 11 n nátriumkarbonát-oldattal 9-re állítjuk be, és 20 liter kloroformmal egyszer, majd 10 liter kloroformmal kétszer extraháljuk. A kapott, összesen 35 liter kivonatot 5—10 Torr nyomáson, 40°-on, 2 literre bepároljuk. A maradékként kapott oldatot 11 n sósavval telített 50 ml n-butanollal megsavanyítjuk, és 1 literre újra bepároljuk. Ezt az 1 liter oldatot lassan 7 liter hexánba öntjük. A kivált csapadékot szűrőn szívatással elválasztva, mosva és szárítva, 13 g nyers, 32 999 RP-hidroklorid antibiotikumot kapunk. C — Tisztítás a) Az antibiotikumot három, A, B és C-vel jelzett 2 literes választótölcsérben ellenáramú megosztással tisztítjuk. 8:2:10 térfogatarányú metilénklorid, n-butanol és 15 mólos, 7,38 pH-értékű foszfátpuffer keveréket állítunk elő. Amikor a keverék egyensúlyi állapotot ért el, a két fázist (nehéz, szerves fázis és könnyű, vizes fázis) elkülönítjük. Az A választótölcsérbe 500 ml 1:125 térfogatarányú, 85%-os foszforsav-víz elegyet és 500 ml, fenti nehéz, szerves fázist töltünk. Ebben a fáziskeverékben feloldjuk a fenti B szakasz szerint előállított 13 g nyers 32 999 RP-hidroklorid antibiotikumot. 15 percnyi keverés és az oldhatatlan anyag szűréssel való eltávolítása után a pH-t n nátriumkarbonát-oldattal 7,5-re állítjuk be. A B és C választótölcsérekbe 500 ml fenti könnyű, vizes fázist töltünk, és a pH-t 85%-os foszforsavval és a B választótölcsérben 7-re, a C választótölcsérben pedig 6,5-re állítjuk be. Az A választótölcsérből kiindulva, a B, majd a C választótölcséren át ellenáramú megosztást hajtunk végre 5 átvitellel, a nehéz fázist (oldószert) mozgó fázisként, és a 7,5—7 és 6,5 pH-jú könnyű (vizes) fázisokat álló fázisként használjuk, és minden esetben 500 ml mozgó fázist alkalmazunk, és az álló fázis pH-ját állandó értéken tartjuk. A C választótölcsérben levő vizes fázis tartalmazza az antibiotikumot, ezt 9,5 pH-nál 500 ml 8 :2 térfogatarányú kloroform-n-butanol eleggyel kétszer extraháljuk. A szerves kivonatokat egyesítve, 5—10 Torr nyomáson és 40°-on bepároljuk. A bepárlás folyamán az oldathoz 6 térfogatszázalék 2 n sósavat tartalmazó 30 ml n-butanolt adunk. Az 5 ml-re bepárolt maradékot lassan 500 ml hexánba öntjük. A kivált csapadékot szűrőn szívatással elválasztva, mosva és szárítva 275 mg, félig tisztított 32 999 RP-hidrokloridot kapunk. b) Az előzőek szerint kapott 80 mg 32 999 RP-hidrokloridot 1 ml víz és 1 ml metanol elegyében oldjuk. Ezt az oldatot 4 Merc-féle kovasavgél vékonyrétegkromatográfiás elemző lemezen egyenes vonal mentén egyenletesen szétosztjuk. A lemezeket 1 óra hosszat olyan tartályban fejlesztjük ki, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 25
