175142. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nyújtott hatású csekély antigénhatással rendelkező inzulin-készítmény előállítására
9 175142 10 oximetil)-amino-me tanból áll, amelynek a pH-értékét jégecettel 8,0-ra állítjuk be. Sephadex G—50 alkalmazásával gélszűréssel tisztított 300 mg szarvasmarha-inzulint 30 ml fenti összetételű puffer-oldatban oldunk, és az oldatot felvisszük az oszlopra, amelyet azután 1 órán át eluálunk 80 ml/óra sebességgel. Az elúciót ugyanilyen ütemben folytatjuk, azonban lineáris gradienst hozunk létre 2000 ml fenti összetételű puffer-oldat és 200 ml, literenként 0,15 mól nátriumkloridot is tartalmazó fenti puffer-oldat alkalmazásával. Az eluátumot frakciókra osztjuk szét. A tiszta frakciókat összegyűjtjük és az inzulin-tartalmat meghatározzuk, m-Krezol hozzáadásával 0,2% m-krezol-tartalmat állítunk be, majd az oldat cink-tartalmát 0,15 mólos cinkklorid-oldattal az inzulin súlyára számított 0,5%-ra állitjuk be. Ezután annyi protaminszulfátot adunk az oldathoz 1%-os vizes oldat alakjában, hogy elérjük az izofán inzulin/protamin arányt. Az elegy et óvatosan keverjük, 15 percig állni hagyjuk, majd 7-szeres térfogatú, 7,3 pH-értékű, 0,2% m-krezolt tartalmazó nátriumfoszfát puffer-oldatot adunk hozzá, és további 16 órán át állni hagyjuk 20 °C-on. Ilyen módon kristályossá válik az amorf alakban kivált pretamin-inzulin komplex. A terméket valamely, önmagában ismert vivő közeg alkalmazásával befecskendezhető inzulinkészítménnyé alakítjuk. Ha a termék 300 /rg mennyiségű mintáját poliakrilamid-gélen izoelektromos fókuszálásnak vetjük alá, reagensként 6 mólos ionmentesített karbamid-oldattal készített, 2%-os amfolin-oldatot (pH 3—10) használva, egyetlen sáv jelenik meg. 12. példa 5 °C-ra hűtött helyiségben 2,6 cm átmérőjű és 12 cm magasságú oszlopot előzetesen puffer-oldattal duzzasztott és egyensúlyba hozott QAE Sephadex A—25 töltettel töltünk meg. A puffer-oldat 7 mólos acetonitrillel készült 0,05 mólos trisz(hidroximetil)-amino-metán-oldatból áll, amelynek a pH-értékét 5 n sósav-oldattal 8,2-re állítjuk be. Sephadex G—50 alkalmazásával gélszűréssel tisztított 300 mg szarvasmarha-inzulint 30 ml fenti összetételű puffer-oldatban oldunk, a pH értékét 2 n nátriumhidroxid-oldattal 9,3-re, majd 2 n sósav-oldattal 8,2-re állítjuk be, és az oldatot felvisszük az oszlopra. Az oszlopot 1 órán át eluáljuk a fenti összetételű puffer-oldattal 75 ml/óra sebességgel, majd az elúciót ugyanilyen ütemben folytatjuk, azonban lineáris grádienst hozunk létre 1800 ml fenti puffer-oldat és 1800 ml, literenként 0,15 mól nátriumkloridot is tartalmazó fenti puffer-oldat alkalmazásával. Az eluátumot frakciókra osztjuk. A tiszta frakciókat összegyűjtjük és az inzulin-tartalmat meghatározzuk. Annyi m-krezolt adunk az oldathoz, hogy az oldat m-krezol-tartalma 0,2% legyen, a cink-tartalmat pedig 0,15 mólos cinkklorid-oldattal az inzulin súlyára számított 0,5%-ra állítjuk be. Ezután annyi protaminszulfátot adunk az oldathoz 1%-os vizes oldat alakjában, hogy elérjük az izoku. inzulin-protamin arányt. Az elegy et óvatosan kevcx jük, majd 15 percig állni hagyjuk és 6-szoios térfogatú, 7,3 pH-értékű, 0,2% m-krezolt tartalmazó nátriumfoszfát puffer-oldatot adunk hozzá, és további 16 órán át állni hagyjuk 20 °C-on. Ilyen módon kristályossá válik az amorf alakban kivált protamin-inzulin komplex. A terméket valamely, önmagában ismert vivő közeg alkalmazásával befecskendezhető inzulinkészítménnyé alakítjuk. Ha a termék 300 pg mintáját poliakrilamid-gélen izoelektromos fókuszálásnak vetjük alá, reagensként 6 mólos ionmentesített karbamid-oldattal készített, 2%-os amfolin-oldatot (pH 3—10) használva, egyetlen sáv jelenik meg. 13. példa A 11. példában ismertetett módon járunk el, azonban puffer-oldatként 5 mólos vizes N-metil-acetamid-oldattal készített és 5 n sósav-oldattal 8,2 pH-értékre beállított 0,05 mólos trisz(hidroximetil)-amino-metánt használunk, és a kristályosításnál az inzulin-oldatot csupán 4-szeres térfogatú foszfát puffer-oldattal hígítjuk. 14. példa A 12. példában ismertetett módon járunk el. Az összegyűjtött tisztított inzulinfrakciókat úgy viszszük fel előzetesen puffer-oldattal duzzasztott Sephadex G—25 anyaggal töltött oszlopra, hogy a felvitt térfogatmennyiség ne haladja meg az oszlop össztérfogatának 20%-át. Puffer-oldatként 1 mólos acetamid-oldattal készített, 7,65 pH-értékű 0,016 mólos dinátriumhidrogénfoszfát-oldatot használunk. Az oszlopot 20 ml/óra/cm2 sebességgel eluáljuk a fenti közeggel. Az inzulint tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, meghatározzuk az inzulin-tartalmat, és az oldat cink-tartalmát 1 mólos acetamid-oldattal készített 0,15 mólos cinkklorid-oldattal az inzulin súlyának 0,5%-ára állítjuk be. Az oldattérfogat egynegyedének megfelelő mennyiségű, 1,5%-m-krezolt tartalmazó 0,01 mólos sósav-oldatot és annyi protaminszulfátot adunk hozzá, hogy elérjük az izofán ínzulin/protamín arányt. Az elegyet 16 órán át állni hagyjuk 20 °C-on. A kivált protamin-inzulin komplex kristályosodik. A kapott termék tisztasága megegyezik a 11. példa termékével. A terméket valamely, önmagában ismert vivő közeg alkalmazásával befecskendezhető inzulinkészítménnyé alakítjuk. A találmány szerinti eljárással előállított protamin-inzulin komplex megváltozott immuntulajdonságainak bemutatására összehasonlító vizsgálatokat végeztünk nyulakon. (Az inzulin és az inzulinszerű anyagok antigén tulajdonságait általában nyulakon vizsgálják.) Az összehasonlító vizsgálatokhoz az alábbi készítményeket használtuk: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
