175142. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nyújtott hatású csekély antigénhatással rendelkező inzulin-készítmény előállítására
3 175142 4 golhatóan kis mértékben váltanak ki inzulin-antitest-képződést (Schlichtcrull: „Monocomponent Insulin and its Clinical Implications”, 1973. március 16 ). Ismert az is, hogy nagy tisztaságú sertés-inzulinból kiindulva olyan nyújtott hatású készítmények állíthatók elő, amelyek rendkívül kis mértékű antigén hatással rendelkeznek [T. Deckert és munkatársai: „Diabetológia” 10, 703—708 (1974)]. Csekély antigén hatással rendelkező, nyújtott hatású inzulin-készítményt szarvasmarha-inzulinból azonban mindeddig nem sikerült előállítani, noha maga a szarvasmarha-inzulin a sertés-inzulinéval azonos analitikai tisztaságú formában rendelkezésre áll, és ez a nagy tisztaságú szarvasmarha-inzulin azonnal ható készítmény formájában beadva antigén hatást egyáltalán nem vagy csak igen kis mértékben vált ki. Figyelembe véve, hogy a világ inzulin-szükségletének túlnyomó részét a szarvasmarha-inzulin fedezi, igen nagy szükség van olyan eljárás kidolgozására, amellyel szarvasmarha-inzulinból is antigén hatástól mentes, nyújtott hatású készítmények állíthatók elő. Az élő szervezet akkor fejleszt ki antitesteket egy kémiai anyaggal (például inzulinnal) szemben, ha az adott anyag primer szerkezete eltérő (Arquilla és munkatársai: „Immunochemistry of Insulin”, Handbook of Physiology 9. fejezet, 160. oldal, 1972) és így a térszerkezete inkompatibilis a szervezettel, amely azt kiveti magától (Arquilla és munkatársai: „Immunology Conformation and Biological Activity of Insulin, Diabetes, 18. kötet, 194. oldal, 1969), vagy az adott kémiai anyag aggregáció útján kialakult összkiteijedése inkompatibilis a szervezettel, amely azt kiveti magából (Arquilla és munkatársai: „Immunochemistry of Insulin”, Handbook of Physiology 9. fejezet, 160. oldal, 1972). Ismeretes, hogy antitest-képződés úgy is előidézhető, ha az adott kémiai anyagot valamely, az immunmechanizmus aktiválására alkalmas komponenssel együtt adják be. Számos kísérlet eredménye igazolni látszik azt a feltevést, hogy az inzulin Fizikai állapota az antitest-képződés szempontjából döntő fontossággal rendelkezik [Kumer és munkatársai: Horn. Metab. Res. 6, 185—177 (1974), Piers és munkatársai: Neth. J. Med. 17, 234-238 (1974)]. Az a tény, hogy a gyorsan ható, nagymértékben tisztított inzulint tartalmazó készítmények egyáltalán nem vagy csak igen kis mértékben váltanak ki antigén reakciót, feltehetően annak tulajdonítható, hogy e készítmények az inzulint monomerként vagy laza aggregátumok formájában tartalmazzák. Ezzel szemben a jelenleg forgalomba kerülő, nyújtott hatású inzulin-készítmények a nagymértékben tisztított inzulint stabil aggregátumok formájában tartalmazzák, ami - elsősorban a szarvasmarha-inzulin esetén - problémák forrása lehet. A szarvasmarha-inzulint tartalmazó, nyújtott hatású készítmények fokozott antitest-képző hatása feltehetően arra vezethető vissza, hogy a szarvasmarha-inzulin a sertés-inzulinnál fokozottabb mértékben hajlamos aggregátumok képzésére. Ismert, hogy a tiszta, adalékanyag-mentes szarvasmarha-inzulin izoelektromos kicsapási tartománya a sertés-inzulinénál szélesebb, azonban a szarvasmarha-inzulin izoelektromos kicsapási tartománya megfelelő adalékanyagok, például fenol vagy m-krezol alkalmazásával a sertés-inzulinéval azonos szélességűvé tehető (1 222 100 sz. nagy-britanniai szabadalmi leírás). A szarvasmarha-inzulin izoelektromos kicsapási tartományának viszonylag széles volta feltehetően arra vezethető vissza, hogy a szarvasmarha-inzulin a semlegeshez közel eső pH-értékeken aggregátumokat képez. A találmány szerint nagy tisztaságú szarvasmarha-inzulinból kiindulva olyan stabilizált inzulin-készítményeket kívánunk előállítani, amelyekben a gyártás, a nyújtott hatású inzulin-készítmények előállítása és tárolása, vagy a felhasználás során nem képződnek antitest-képződést kiváltó aggregátumok. E feladatot úgy oldottuk meg, hogy az inzulin és az amino-csoportokat tartalmazó szerves bázis közötti reakciót stabilizátort tartalmazó, 6—9 közötti pH-értékű vizes puffer-oldatban végezzük. A stabilizátor az inzulint oldott és stabilizált monomer vagy laza aggregátum alakjában tartja, tulajdonképpen proteint oldó vagy proteint depolimerizáló szer. Stabilizátorként például karbamidot, kisszénatomszámú alkanolt, így metanolt vagy etanolt, dialkilformamidot, ecetamidot, N-alkil-acetamidot, acetonitrilt, stb. alkalmazhatunk. Különösen előnyös stabilizátor a karbamid. Vizes puffer-oldatként önmagában ismert puffer-rendszerek oldatait használhatjuk, 6—9 közötti pH-értéken. így előnyösen trisz[trisz(hidroximetil)-amino-metán] kívánt esetben sósavval vagy jégecettel 7,3—8,1 közötti pH-értékre beállított oldatát, vagy nátriumdihidrogénfoszfát és dinátriumhidrogénfoszfát célszerűen 6-os pH-értékű elegyét, vagy ammóniumhidroxid és ammóniumklorid célszerűen 9-es pH-értékű elegyét alkalmazhatjuk. A találmány szerinti reakcióhoz szerves bázisként különösen előnyösen alkalmazhatunk polipeptideket, például poli-L-arginint, szomatosztatint, protamint, illetve e vegyúletek hasításával előállított, kisebb molekulasúlyú termékeket vagy globint. Előnyös bázisként bizonyult továbbá az 1,3-bisz(4-amino-2-metil-6-kinolil)-karbamid, a surfene, amely nem polipeptid. Azt tapasztaltuk, hogy az inzulin és a szerves bázis reakcióját meggyorsítja, hogyha azt stabilizátorként karbamid jelenlétében hajtjuk végre. Célszerűen úgy járunk el, hogy a karbamidot mintegy 2—7 mólos koncentrációban alkalmazzuk és a reakcióterméket a reakcióelegy hígításával leválasztjuk. A találmány szerint tehát úgy állítunk elő stabil, nyújtott hatású, csekély antigén hatással rendelkező inzulin-készítményt tisztított szarvasmarha inzulin és valamely amino-csoportokat tartalmazó szerves bázis, mint protamin vagy poli-L-arginin reakciója útján, hogy a reakciót stabilizátor jelenlétében, 6—9 közötti pH-értékű vizes puffer-oldatban végezzük, és a kapott terméket elkülönítjük. A találmány szerint előnyösen a következőképpen járunk el: Az inzulin kromatográfiás tisztításával kapott, inzulin-tartalmú frakció - ahol eluálószerként stabilizátort tartalmazó vizes puffer-oldatot alkalmaztunk — amino-csoportokat tartal-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
