174931. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hústermelő háziállatoknak orális úton beadható készítmény előállítására
174931 8 fenti koncentrátumból az alábbi eljárások valamelyikével nyerjük ki: A) Az etilacetátos koncentrátumot híg nátriumhidrogénkarbonát-oldattal mossuk (500 ml; víz és telített nátriumhidrogénkarbonát oldat 9-10 pH-jú elegye). A vizes fázist elválasztjuk, 1 liter kloroformmal mossuk; a kloroformos oldatot elöntjük. A vizes fázist híg sósavval pH=3,5 értékre savanyítjuk, 2x1 liter dietiléterrel mossuk, az éteres fázist elöntjük, majd 2x1 liter etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos extraktumokat egyesítjük, nátriumszulfát felett szárítjuk, szűrjük és a szűrletet szárazra pároljuk. A maradékot dietiléterrel kezeljük. Sárgásbarna szilárd anyag alakjában nyers mithramicin-keveréket kapunk. B) Az etilacetátos koncentrátumot szárazra pároljuk. A gumiszerű maradékot (11 g) metanolban oldjuk és az oldatot 2 g kieselguhron adszorbeáljuk. Az oldószert elpárologtatjuk és a megszárított anyagot kloroformmal feltöltött kieselguhr-oszlop (40x6,5 cm) tetejére felvisszük. Az oszlopot kloroformmal eluáljuk és 15 ml-es frakciókat gyűjtünk össze. A frakciókban a kívánt mithramicin-komponensek jelenlétét vékonyrétegkromatográfiás úton mutatjuk ki (szilikagél Merck 254 lemezeken, eluálószerként 48:8:8 térfogatarányú kloroform/metanol/98 tf%-os hangyasav elegyet alkalmazunk). A kívánt terméket tartalmazó 50-250. frakciót egyesítjük és szárazra pároljuk. Sárgásbarna szilárd anyag alakjában 1,9 g nyers mithramicin-keveréket kapunk. 7 2. példa 3,4 g, az 1. példa szerint készített nyers mithramicin-keveréknek vizes metanollal képezett oldatát 28 x 5 cm méretű előduzzasztott térhálós dextrán oszlop (Sephadex G—25 védjegy) tetejére visszük fel és az oszlopot vízzel eluáljuk. A mithramicin sárgászöld gyorsan mozgó sáv alakjában halad át az oszlopon és az eluátum megfelelő frakcióit összegyűjtjük oly módon, hogy a) az eluátumot fagyasztva szárítjuk; 2,5 g sárga liofilizált szilárd anyagot (mithramicin-keverék) kapunk; vagy b) az eluátum pH-ját híg sósavval 3,5-re állítjuk be, etilacetáttal extraháljuk, az extraktumot szárítjuk és szárazra pároljuk. 169—172 *C-on olvadó sárga por alakjában 2,3 g mithramicin-keveréket kapunk. Az ily módon kapott mithramicin keveréket a következőképpen alakíthatjuk a főkomponens magnézium-kelátjává. 400 mg mithramicin-keverék etilacetátos oldatához 6 g magnéziumszilikátot („FlorisiT-védjegy) adunk és az etilacetátot ledesztilláljuk. Az abszorbeált mithramicin-keveréket tartalmazó Florisilt 40 x 2 cm méretű Florisillel töltött oszlop tetejére visszük fel és az oszlopot egymás után i) etilacetáttal ii) 5 tf/tf% metanolt tartalmazó etilacetáttal, üi) 10 tf/tf% metanolt tartalmazó etilacetáttal, iv) 15 tf/tf% metanolt tartalmazó etilacetáttal, eluáljuk. A iii) és iv) frakciót egyesítjük és az oldószert ledesztilláljuk. A maradékot metanol-etilacetát elegyből kristályosítjuk. Sárga kristályok alakjában magnéziumkelátot kapunk. Op.: 210—217 °C (bomlás). [a]o3 = +85° (c=0,5% metanolban). Analízis (CsjE^sC^OîMg^HîO képletre számított: C% = 56,0; H% = 7,0 talált: C% = 56,0; H% = 7,2. A fenti adatok a 3 906 093 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban a Streptomyces argillaceus ATCC 12 956 vagy S. plicatus ATCC 12 957 törzs fermentációja útján készített mithramicin A magnézium-kelátjára közölt értékekkel közeli egyezést mutatnak. 3. példa 250 mg, az 1. példa szerint készített nyers mithramicin-keverék oldatát minimális mennyiségű metanolban oldjuk és 25 x 2 cm méretű szilikagél oszlop tetejére felvisszük. Az oszlop készítése során alsó fázisként azonos térfogatú kloroform-metanol-ammóniumliidroxid-oldat elegyet alkalmazunk. Az oszlop eluálására ugyanazt az alsó fázist alkalmazzuk és a fő sárga sávot összegyűjtjük. Az oldószert ledesztilláljuk. A kapott sárga port 10 ml vízben oldjuk, az oldat pH-ját híg sósavval 3,5 értékre állítjuk be és 2 x 15 ml etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos extraktumot szárazra pároljuk. Sárga por alakjában 100 mg mithramicin-keveréket kapunk. Op.: 169-172 8C. 4. példa 20-20 találomra kiválasztott 1 napos csirkéből (a táblázatok fejlécében és a továbbiakban: „madár”) álló csoportok állatait faforgáccsal borított és automatikus itató kutakkal ellátott kis ketrecekbe helyezzük. 16 találomra kiválasztott ketrecben levő madarat 6 napon át növekedésserkentőt nem tartalmazó, táplálkozási szempontból kiegyensúlyozott táppal etetjük, míg a többi ketrecben levő madarak (minden dózis 4-4 ketrec) ugyanezen idő alatt azonos összetételű, azonban megadott menyiségű, a 2. vagy 3. példa szerint előállított mithramicin-keveréket vagy ismert csirke növekedésserkentőt, (penicillint vagy nitrovint) pozitív kontrollként tartalmazó tápot kapnak. A kísérleti időszak végén a kontroll csoport egyes madarainak átlagsúlyát meghatározzuk és az egyes teszt-csoportoknak a kontroll csoporthoz viszonyított százalékos súlyhozam-növekedését kiszámítjuk. Az eredményeket az alábbi táblázatban foglaljuk össze: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
