174894. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kinetikus szubsztrátmeghatározásra és reagens ennek kivitelezéséhez
174894 12 11 Hogy a minta teljesen elszappanosodjon, a továbbító korongnak pipettázás után 10 percig állni kell. h2o2 +ch3oh kataláz EC. 1.11.1.6. *H2CO + 2H20 GEMSAEC ANALYZER hőmérséklet: előszűrő: hullámhossz: GEMSAEC CONTROL a reakciójelleg: az üzemelés módja: az első leolvasás (IR): a leolvasás intervalluma (Rí): a leolvasások száma (NR): GEMSAEC COMPUTER 5 h2co + 2ch3coch2coch3 + nh3—► 25 °C 335—385 nm 340 nm 10 II loi e f 1 RATE AUTO 80 másodperc 99 másodperc 2 15 c«rc' ch/ x; H Xr ch3 20 X = max 412 nm + 3H20 ch3 A számítógépbe betáplált adatok: IR = 80 Rí = 99 NR = 2 25 SC = 200 (illetve 2,29 mmól/liter) KT(nem alkalmazzuk) TF = 1 TC = 1 AD = 4 30 CD = 0 Hl = 172 (illetve 1,97 mmól/liter) LO = 74 (illetve 0,85 mmól/liter) SA = 0,4 RM = 2 35 XX = 0 Normál értéknek tekinthető a 74-172 mg/100 ml, illetve a 0,85-1,97 mmól/liter érték. 40 A kalibrálást a Boehringer Mannheim GmbH Precimat Glycerin néven kereskedelmi forgalomba hozott termékével, az ellenőrzést ugyancsak a Boehringer Mannheim GmbH Precinorm U, Precilip 45 stb. elnevezéssel kereskedelmi forgalomba hozott termékével végezhetjük. A koleszterinészteráz és koleszterinoxidáz enzimek túladagolásával a pszeudo-első rend szerint végbemenő színreakció lesz sebességmeghatározó. Az eljárást például Eppendorf 5032 automatán a következő reagenssel valósítjuk meg: 0,45-0,75 mól/1 1,36-2,04 mól/1 16—24 mmól/1 0,79-1,19 g/1 5 x 105 E/l 20 E/l 20 E/l 7,0 pH-jű ammónium-foszfát-puffer, metanol, acetil-aceton, hidroxi-polietoxi-dodekán, vagy több kataláz, vagy több koleszterinészteráz, vagy több koleszterinoxidáz. Hasonló módon összeállított vakpróba-reagens nem tartalmazza a koleszterinoxidázt. A meghatározás Eppendorf 5032 automatán történő kivitelezéséhez a vizsgálandó minta 0,01 ml-ét 1,0 ml reagenssel elegyítjük, és 37 °C-on 20 percig inkubáljuk. Utána az extinkciót Hg 405 nm-nél olvassuk le. Ugyanilyen összetételű vakpróbánál, amely nem tartalmazza a koleszterinoxidázt, ugyanígy járunk el. A minta és a vakpróba közötti extinkciókülönbségből számítjuk ki a koleszterinmennyiséget. 3. példa összkoleszterin. 50 Regressziós egyenes y = 0,98 x + 1,98, Korrelációs koefficiens r = 0,997. A meghatározás a következő egyenletek szerint történik: 55 Koleszterinészter + „ koleszterin-észteráz + H20«=—— - =» EC 3.1.1.13 koleszterin + zsírsav 60 , . . , ^ koleszterin-oxidáz . kolesztenn + 02----------------------- kolesztenon + + H202 65 Részletes előírások az Electro-Nucleonics Inc. GEMSAEC elnevezésű gyors elemzőkészülékével végzett koleszterinmeghatározáshoz: A meghatározás a fenti egyenletek alapján történik. A vizsgálathoz szérum, heparin- vagy EDTA-plazma alkalmazható, mely +4°C hőmérsékleten 6 napig tárolható. A vizsgálathoz a Boehringer Mannheim GmbH által gyártott, következő használatra kész reagens-oldatokat alkalmazzuk: 6
