174891. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimatikus átalakítások végrehajtására vizes közegből apoláros folyadékokkal elválasztható enzimkészítményekkel
21 174891 22 szakításakor jeges hűtést alkalmazunk. A kapott emulziót 100 g értéken 15 percig centrifugáljuk. A felső fázist háromszor mossuk 25 ml nátrium-foszfát pufferoldattal. A felső fázis végső térfogata 11 ml és aktivitása 1050 egység/ml. A visszanyert 5 aktivitás közelítőleg 5%. a) Hidrolizált n-oktadecil-amino-GANTREZ AN 119-hidrazid (GAN 119 ODH) 5 g GANTREZ AN 119-et 20 ml dimetilformamidban feloldunk, és az oldat hőmérsékletét 15 vízfürdővel 60 °C-ra emeljük. Ehhez az oldathoz 2,8 g n-oktadecil-amint adunk 30 ml forró (80 °C) dimetilformamidban, és az elegy hőmérsékletét 1 órán keresztül 60 °C-on tartjuk. Ezután az elegyet szobahőmérsékletre hűtjük, majd ezen a 20 hőmérsékleten 50 ml dimetil-formamidban oldott 10 ml hidrazin-hidráthoz adagoljuk. A reakcióelegyben egy enyhén barnás csapadék keletkezik. A keveréket 10 percen át keverjük és 500 ml vízzel felhígítjuk. Ilyen módon egy szappanszerű zöld oldat 25 képződik, melynek pH-ját 15 perces keverés után koncentrált sósav-oldattal 7,0 értékre állítjuk, és az elegyhez 50 g nátrium-kloridot adunk. A koaguláció megkezdődik, és a kapott szuszpenziót 10000g/4 °C-értéken 30 percig centrifugáljuk. Az 30 üledéket 400 ml vízzel újra szuszpendáljuk és 4°C-on 16 órán át keverjük, majd ezt követően a fenti módon ismét centrifugáljuk, melynek során 39 g nedves súlyú kékesszürke színű terméket kapunk. 35 b) Penicillin-aciláz (n-oktadecilamino-GANTREZ AN 119)-hidrazid PAGAN 119 ODH 40 5 g nedves súlyú GAN 119 ODDH-t 50 ml 2 n sósavval szuszpendálunk és 15 percen keresztül 0 °C-on tartjuk. 0,5 g nátrium-nitritet 5 ml vízben oldunk, az oldatot a fenti szuszpenzióhoz adjuk, és a kapott elegyet 0 °C-on 10 percen keresztül 45 keverjük, majd 25 000 g értéken 0 °C-on 30 percen keresztüi centrifugáljuk. A kapott terméket 0 °C-on 50 ml 0,1 M nátrium-foszfát pufferoldattal (melynek pH-értéke = 8) újra szuszpendáljuk. Ezt a szuszpenziót adjuk a penicillin-aciláz oldatához 50 (100 ml-ben 55 mg protein) majd az elegy pH-ját 8-ra állítjuk. A szuszpenziót 72 órán keresztül 4 °C-on keverjük, ezt követően 25 000 g értéken, 0 °C-on 1 órán át centrifugáljuk. A terméket 0,1 M (pH = 7,0 értékű) nátrium-foszfát pufferoldattal is- 55 mét felszuszpendáljuk és centrifugáljuk. A végtermék súlya: 3,74 g. Specifikus aktivitása: 5,2x10"5 mól/perc/gramm (meghatározás az előbbiekben ismertetett módon). Visszanyert aktivitás: 32,5%. 60 A fenti kapcsolt enzimet 0,29 g/ml koncent rációban 2,5 ml 0,1 M (pH = 7,0 értéket tartó) nátrium-foszfát pufferoldattal szuszpendáljuk, majd 20 ml 0,02 M nátrium-foszfát pufferoldattal (pH = 7,9) keverjük össze és 7,5 ml n-dekanoHal 65 0 °C-on 2 percen keresztül homogenizáljuk, és 5 000 fordulat/perc értéken 10 percen keresztül (100 g) centrifugáljuk. Ilyen módon két fázist kapunk. Az első fázis teljes aktivitása 1,8 x 10'6 mól/perc, a felső fázis aktivitása 20 ml fenti koncentrációjú pufferoldattal végzett mosás után 1,9 x 10"5 mól/perc. A specifikus aktivitások aránya [felső/alsó, térfogatra számolva] közelítőleg 30. A felső fázis további ciklusainak eredményét a 7. táblázatban mutatjuk be. 7. táblázat A PAGAN 119 ODH-n-dekanol fázis kezdetihez viszonyított aktivitása az flotációs ciklusokban egymás után következő Ciklusszám %-os aktivitás 1 90 2 84 3 74 14. példa Benzil-penicülin enzimatikus bontása 6-APS-előállítása céljából 1,0 g GANTREZ AN 119-et 10 ml dimetilformamidban feloldunk, és az oldathoz 0,56 g oktadecil-amint adunk. Az elegyet egy éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük. 48 ml részlegesen tisztított penicillin-aciláz enzim pH-ját 1M nátriumkarbonát-oldattal 9-es értékre állítjuk. Ezután a GANTREZ-gyanta oldatát adjuk az oldathoz. A két adagolás között 2 részletben homogenizációt és megfelelő pH-állítást végzünk. A keveréket ezután 3 órán keresztül keverjük, a pH-t 9,0 értéken tartjuk 1 M nátrium-hidroxid-oldat adagolásával. Az enzim-gyantát centrifugálással nyerjük vissza, majd szuszpendálásnak vetjük alá. A szuszpendálást 120 ml 0,1 M (pH = 7,0 értéket tartó) foszfátpufferrel végezzük és 30 másodpercig homogenizáljuk. Az enzimgyantát centrifugálással nyerjük vissza, majd a mosást megismételjük. 20 g enzim-gélt 80 ml n-dekán és 20 ml (pH = 7,8 értékű) 0,02 M foszfát-pufferoldat keverékével homogenizáljuk 1 percen keresztül. Az így kapott homogenizátumot 250 ml desztülált vízbe öntjük. Az elegyet 37 °C-ra melegítjük, a pH-t 7,8 értékre állítjuk és az elegyhez 21,8 g benzil-penicillin-káliumot adunk. Az elegyet 5 órán át keverjük, a pH-t 7,8 értéken tartjuk 4 súlyszázalékos nátrium-hidroxid-oldattal. A reakció végén az elegyet választótölcsérbe helyezzük és az enzimet hagyjuk a vizes fázistól elválni. Ez 30 perc alatt megtörténik. A vizes fázist ezután eltávolítjuk és a 6-amino-penicülánt a következő módon extraháljuk ki: Az oldatot egy-negyedére pároljuk be, lehűtjük 5 °C-ra és keverés közben azonos térfo-11
