174887. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gonococcus szálak előállítására
23 174887 24 Abban az esetben, ha T2 szálak helyett Ti szálakat kívánunk tenyészteni, az alkalmazott trisz-tartalmú fiziológiás sóoldat pH-értéke 7,0-7,2. A jó tenyészet jellegzetes narancs/piros vagy élénkpiros színű, a szaga pedig a főtt ételre emlékeztet. A tenyészet tapadós. síkos aggregátumokká áll össze, és könnyen le csúsztatható az agar-agar felületéről üvegbottal. A táptalajt tartalmazó tálakat ezután megtisztítjuk, kimossuk és sterilizáljuk a fentebb ismertetett módon, majd újra megtöltjük táptalajjal. 5. példa A GC szálak tenyésztése süllyesztett táptalajon A 4. példában ismertetett módon járunk el, azzal az eltéréssel, hogy bár ugyanolyan táptalajt és tápadalékot alkalmazunk, az agar-agart elhagyjuk, és az oldhatatlan keményítő helyett oldható keményítőt használunk. Az oltóanyagot felvisszük a táptalajra, és 18 órán át inkubáljuk enyhe keverés közben 35-37 °C-on 95% levegőt és 5% széndioxidot tartalmazó atmoszférában, maximálisan (a cseppfolyós közeg térfogatára számított) 0,5% celit jelenlétében. A tápközeget ezután durva, zsugorított üvegszűrős tölcsérre helyezett szendvics szűrőn keresztül szűrjük. A szendvics szűrő durvapórusú szűrőpapírt, 5 mm vastagságú celit réteget és újabb durvapórusú szűrőpapírt tartalmaz. A szűrletet elöntjük, a maradékot pedig a 4. példa szerinti harmadik (etanolaminos) mosásnak vetjük alá. A mosófolyadékot ezután a 6. példa iü) pontja szerint dolgozzuk fel. 6. példa A GC szálak elválasztása a sejtektől és a törmeléktől i) Az előző példákban kapott, trisz-tartalmú sóoldatos szuszpenziókat centrifugacsövekbe töltjük (a csövek térfogata függ attól, hogy hány sarzs szuszpenzióját egyesítettük), és 15 percig centrifugáljuk 3 KG sebességgel. A folyadék tisztáját elöntjük, a szemcsét pedig félretesszük. ii) A szemcséhez hozzáadjuk a tenyészetet tartalmazó tálcák harmadik mosásakor kapott etanolaminos szuszpenziót, és annyi további 10,1-es pH-értékű etanolamin pufferoldatot, hogy a térfogat közelítőleg háromszorosa legyen a centrifugacsőben megfigyelt szemcsetérfogatnak. A folyadékfázist 5 másodpercig gyorsan keverjük keverőgép segítségével, hogy a szemcse anyagának oldható részét a szuszpenzióba vigyük. iii) A szuszpenziót ezután 15 percig centrifugáljuk 3 KG sebességgel, az oldat tisztáját dekantálással eltávolítjuk a szemcséről és félretesszük. A szemcsét ismét a térfogata háromszorosának megfelelő mennyiségű, 10,1-es pH-értékű etanolamin pufferoldatban szuszpendáljuk, és újból 15 percig centrifugáljuk 3 KG intenzitással. Az oldat tisztáját dekantálással eltávolítjuk, és egyesítjük az előző lépés során kapott etanolamin puffer tisztájával, a szemcsét pedig elöntjük. Az egyesített etanolaminos pufferoldatokat 60 percig centrifugáljuk 31 KG intenzitással. A folyadék tisztáját dekantálással eltávolítjuk és félretesszük, a szemcsét pedig elöntjük. 7. példa A GC szálak kristályosítása Dializáló cső és trisz puffert tartalmazó fiziológiás sóoldat készítése Egy tekercs dializáló csövet (30,5 m hosszúságú, Fisher Scientific Catalog No. 8-677 B) egymást követően forralunk a) desztillált vízben (kétszer, 4 litert használva minden alkalommal), b) vizes nátriumhidrogénkarbonát-oldatban (kétszer, minden alkalommal 2 kávéskanálnyi mennyiségű nátriumhidrogénkarbonátot tartalmazó 4 liter desztillált vizet használva), c) vizes etiléndiamin-tetraecetsav-dinátriumsó-oldatban (kétszer, minden alkalommal 2 kávéskanálnyi EDTA-dinátriumsót adva 4 liter desztillált vízhez), d) vizes etanolban (kétszer, minden alkalommal 4 liter 1 :1 arányú etanol/víz elegyet használva), e) desztillált vízben (kétszer, 4 litert használva minden alkalommal). A dializáló csövet ezután nyomnyi mennyiségű benzoe savat tartalmazó desztillált vízben tároljuk (4 liter desztillált vízhez 1 kávéskanál benzoesavat adunk). A 4. példában leírt módon előállított, trisz puffert tartalmazó fiziológiás sóoldat desztillált vízzel történő hígításával készítjük el a dializáló oldatot. (166 ml törzsoldatot desztillált vízzel 1 liter térfogatúra hígítunk). A GC szálakat tartalmazó oldat dialízise Az előző példák szerint kapott, a GC szálakat oldatban tartalmazó 100 ml etanolaminos pufferoldatot 4 liter trisz puffert tartalmazó, a fentiek szerint hígított fiziológiás sóoldat jelenlétében dializálunk (a 20 °C-on mért pH értéke 8,5), a fentebb előkészített dializáló csövet használva. A dialízist hideg helyiségben (körülbelül 4°C hőmérsékleten) hajtjuk végre. A külső dializáló pufferoldatot mágneses keverővei kevertetjük. A dialízist 18 órán át végezzük. A dialízis folyamán a dializáló közeg pH-értéke mindegy 8,7-re növekszik, és a dialízis végén kékesfehér színű, kettőstörést mutató csapadék képződik, amely GC szál kristályokból áll. Az ilyen módon leválasztott anyagot 7500 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk 60 percig, a folyadék tisztáját elöntjük, a szemcsében pedig visszamaradnak a Neisseria gonorrhœae Pittsburgh 3—2 (ATCC 31149) törzs szál kristályai. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
