174820. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új policiklusos éter tipusú antibiotikum előállítására
5 174820 6 tenyészléből extrahált nyers és tisztított termékek analízisét szilikagéllel kivitelezett vékonyréteg-kromatográfrával végezzük. Az etil-acetátos futtatás után kapott vékonyréteget etanolos kénsavval (98,5% : 1,5% v/v) készült 3%-os vanillin oldattal permetezzük be, majd néhány percen át 60 °C és 80 8C közötti hőmérsékleten hígítjuk. Az antibiotikum mint egy fényes, rózsszínű-vörös folt jelenik meg a fehér háttér előtt. A feltisztult tenyészléből a 38 295 jelű antibiotikumot a találmány szerinti eljárás egyik előnyös kivitelezési változata szerinti szerves oldószeres, például kloroformos, etil-acetátos vagy metil-izobutil-ketonos extrakcióval különítjük el, és nyerjük ki. Az antibiotikum nagyobb része az elkülönített micéliumon marad, és innen előnyösen a micéliumnak egy vízzel elegyedő oldószerrel, például metanollal való extrakciójával különítjük el. A 38 295 jelű antibiotikum elkülönítésére és kinyerésére a találmány szerinti eljárás egyik előnyös kivitelezési változata szerint az alábbiak szerint járunk el. A nem szűrt, teljes tenyészlevet 1/5 és 1/2 közötti térfogatú metil-izobutil-ketonnal kétszer extraháljuk. Az oldószeres extraktumot csökkentett nyomáson töményítjük, a desztillációs maradékként kapott olajos maradékot kloroform és hexán 1:1 arányú elegy éhez adjuk, majd szilikagél kromatografáló oszlopra öntjük; az oszlopot előnyösen szilikagél 60-nal készítjük, felső részére szilikagél PF254-et rétegezőnk; mindkét gél a Merck, Darmstadt terméke. Az oszlop eluálását hexánnal, majd kloroform és hexán 1:1 arányú elegyével, végül kloroformmal végezzük. Az antibiotikum nagy részét tartalmazó frakciót etil-acetáttal eluáljuk. Az eluátumot csökkentett nyomáson töményítjük, a desztillációs maradékhoz acetont adunk, majd aktív szénnel (Dareo G 60) 30—60 percen át keveijük. Szűréssel eltávolítjuk az aktív szenet, a szűrletet csökkentett nyomáson kis térfogatúra töményítjük, kevés vizet adunk hozzá, és pH-ját nátriumhidroxiddal 8,0 és 8,5 közötti értékre állítjuk be. Szűréssel elkülönítjük a kivált kristályos anyagot, vízzel mossuk és szárítjuk. Az elkülönítés ezen szakaszában kapott antibiotikum a tenyészléből és az adagolt nátriumhidroxidból származó nátrium- és káliumionokkal képzett 38 295 nátrium- és káliumsó-keverék. Ez az anyag a vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat szerint nyomnyi mennyiségben még legalább két polárosabb antibiotikumot is tartalmaz, amelyek-a 38 295 antibiotikumhoz hasonlóan jellemző rózsaszínű-vörös foltot ad az etanol és kénsav elegyében oldott vanillinnal való bepermetezés után. A 38 295 jelű antibiotikum homogén anyagként PF2S4 szilikagéllel és hexánnal, mint eluálószerrel végzett oszlopkromatográfiával kapható meg. A nátrium- és káliumsót tartalmazó keveréket etil-acetátban vagy kloroformban oldjuk, az oszlopot 5,2 atmoszféra nyomáson növekvő menyiségű etil-acetátot tartalmazó hexánnal eluáljuk. Az elkülönülést vékonyréteg-kromatográfiával követjük. Egyesítjük a megfelelő frakciókat, csökkentett nyomáson desztilláljuk az oldatot, az antibiotikumot aceton és víz elegyéből kikristályosítjuk. A 38 295 antibiotikum szabad savas alakját a nátrium- és káliumsót tartalmazó keverékből állítjuk elő oly módon, hogy etil-acetáttal vagy kloroformmal készült oldatának pH-ját híg foszforsavval 4,5-re állítjuk be. Vízmentes nátriumszulfát felett szárítjuk a szerves oldószeres oldatot, csökkentett nyomáson desztilláljuk, a desztillációs maradékot pedig kloroform és hexán elegyéből kikristályosítjuk. A 38 295 antibiotikum nátriumsójának előállítására a szabad sav etil-acetáttal vagy kloroformmal készült oldatának pH-ját 1 n nátriumhidroxid oldattal 8,5-re állítjuk be. A terméket aceton és víz elegyéből kristályosítjuk ki. A kristályos káliumsó előállítására hasonlóan járunk el, de nátriumhidroxid helyett káliumhidroxidot használunk. Az antibiotikum kristályos ezüstsójának előállítására a 38 295 jelű vegyidet nátriumsót és káliumsót tartalmazó keverékét etanolban oldjuk, majd az oldathoz vizes ezüstnitrát oldatot adunk. Előállíthatjuk a 38 295 jelű antibiotikum réz-, cink-, ammonium-, kalcium-, magnézium- és lítiumsóját is. A baromfiak coccidiozisos megbetegedésének megakadályozására és kezelésére eljárhatunk úgy is, hogy a 38 295 antibiotikumot tartalmazó teljes tenyészlevet megszárítjuk (előnyösen nirózzuk), és a kívánt antibiotikum-tartalom szerinti mennyiségben a baromfitakarmányba keveijük. A találmány szerinti eljárással előállított 38 295 jelű antibiotikum sok mikroorganizmus növekedését gátolja. Az adatokat az 1. táblázatban adjuk meg. A vizsgálandó mikroorganizmust annak növekedését 24 óra alatt gátló legkisebb, jug/ml-ben megadott növekedésgátló koncentráció meghatározására egy sor, táptalajt (nutrient) és különböző mennyiségű 38 295 antibiotikumot tartalmazó esőben tenyésztjük. A találmány szerinti eljárással előállított 38 295 antibiotikum és ennek sói rendkívül hatékonyak a baromfiak coccidiozisos megbetegedésének kezelésekor. Ha a vegyületet 15 és 250 rész/miilió rész mennyiségben csirkék táplálékába adagoljuk, úgy az hatásosan gátolja az Eimeria tenella, Eimeria acervuli! na, Eimeria maxima stb. egyenkénti és vegyes fertőzéssel kiváltott megbetegedéseket, j A találmány szerinti eljárással előállított 38 295 jelű antibiotikum és sóinak csirkék coccidiozisos meg! betegedése ellen kifejtett hatását a következők szerint vizsgáljuk. 3—5 tagú csoportokba osztott SPF fehér leghom kakasokat egyenletesen elkevert 38 295 antibiotikumot vagy ennek egy sóját tartalmazó pépes táplálékkal etetünk. Miután 24 órán át ezt a takarmányt kapták az állatok, mindegyik csirkét per os az egyes vizsgálandó eimeria oocisztáival oltunk be. Hasonlóképpen fertőzzük antibiotikum-mentes táplálékkal etetett csirkecsoportokat, amelyeket fertőzött kontrollként vizsgálunk. A nem fertőzött és nem kezelt csirkék a normális kontrollok. A kezelés eredményeit az Eimeria acervulina esetében 5 nap, más Eimeria fajok esetén 6 nap után állapítjuk meg. A 38 295 jelű antibiotikum nátrium- és káliumsójának keverékével kapott eredményeket a 2. táblázatban adjuk meg. +A coccusellenes aktivitás mérése az Eimeria tenella esetén a kóros elváltozás mértékétől függően 0-tól 4-ig terjedő számozással [Lynch. Am. J. Vet. Rés., 22, 324-326. (1961)], más fajok esetén 0-tól 3-ig terjedő számozással történt [Johnson és Reid, Exp. Parasit., 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
