174782. lajstromszámú szabadalom • Eljárás restrikciós endonukleáz előállítására bacillus sphaericusból
MAGYAR NÉPKÖZTÁRSASÁG SZABADALMI LEÍRÁS 174782 JL SZOLGÁLATI TALÁLMÁNY JBÉjk Nemzetközi osztályozás: ipt Bejelentés napja: 1976. VII. 27. (MA-2798) C 07 G 7/028 C 12 D 13/10 Közzététel napja: 1979. IX. 28. ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL Megjelent: 1980. IX. 30. Feltalálók: Szabadalmas: Dr. Kiss Antal orvos, 35%, Sain Béla oki. vegyész, 25%, MTA Szegedi Biológiai Venetianer Pál biológus, 25%, Csordás-Tóth Éva oki. vegyész, 15%, Központ, Szeged Szeged Eljárás restrikciós endonukleáz előállítására Bacillus sphaericusból 1 A találmány tárgya eljárás 5’GGCC-specifikus restrikciós endonukleáz (Bsp) előállítására Bacillus sphaericus R-ből. Ismeretes, hogy egyes baktériumok szekvencia-specifikus endonukleázokat vagy más néven restrikciós endonukleázokat termelnek, mely enzimek a kettes szálú dezoxiribonukleinsavakat specifikus helyeken hasítják. Ezek a helyek 4—6 bázispárból álló polindrom szerkezetű nukleotid szekvenciák. A restrikciós enzimek tették lehetővé az addig csak genetikai kísérletek számára hozzáférhető DNS molekulák biokémiai módszerekkel történő tanulmányozását. Sokrétű felhasználásuk alapja az, hogy segítségükkel bármely DNS molekula jól meghatározott fragmentekre hasítható. A restrikciós endonukleázok eddigi fő alkalmazási területe a kis genomok (vírus DNS-ek) fizikai térképezése. Ennek lényege, hogy meghatározzák a különböző restrikciós hasítási helyek elhelyezkedését a DNS molekulán, majd az emésztés során keletkezett fragmenteket izolálják és további analízisnek vetik alá, így pl. transzfekciós kísérletek vagy szekvenciaanalízis kiindulási anyagának használják. Ilyen módon a genetikai térképekhez fizikai tartalom rendelhető. A restrikciós enzimek felfedezése tette lehetővé a génsebészet („genetic engineering”) technikai kidolgozását, mely tudományos jelentőségén túlmenően rendkívüli gazdasági lehetőségeket is rejt magában azáltal, hogy megnyitotta az utat ipari szempontból fontos mikroorganizmusok 174782 2 örökletes tulajdonságainak irányított megváltoztatására. Az elsőként felfedezett II. típusú restrikciós endonukleáz, a Haemophilus influenzae-ből izolált Hind II 5 leírása óta kb. 80 olyan baktériumot találtak, amelyben szekvenciaspecifikus endonukleáz van. (A restrikciós endonukleáz és a szekvenciaspecifikus endonukleáz fogalmak összemosódtak, mert a gyakorlati felhasználás szempontjából nincs jelentősége a megkü- 10 lönböztetésnek.) Az enzimek többségét nem írták le, csak személyes közlésekből tudunk létezésükről. A restrikciós enzimeket a baktérium genus első és a species első két betűjéből képzett névvel jelölik; ha több enzimet találtak ugyanabban a fajban, kiegészítő 15 betű-, illetve számjelzéseket alkalmaznak. (A Hind III. pl. a Haemophilus influenzae d szerotípusból izolált III jelű enzimet jelöli.) A II. típusú restrikciós endonukleázok specificitásának jelölésére azt a nukleotid-szekvenciát alkalmaz - 20 zuk, amelyet az illető enzim a kettős spirálú DNS láncban felismer, hozzákötődik, és a szekvencián belül mindkét szálban meghatározott helyen elhasít két szomszédos nukleotid közötti kötést. A nukleotidok jelölésére a nemzetközileg elfogadott rövidítéseket 25 használjuk [J. Biol. Chem. 241, 527—533 (1966)]. Ennek megfelelően A adenozin-monofoszfátot, T timidin-monofoszfátot, C citidin-monofoszfátot és G guanozin-monofoszfátot jelöl; 5’ a nukleotid láncnak a szélső nukleotid 5’ helyzetben szabad foszfáttal 30 rendelkező végét jelöli.
