174764. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimatikus és biokémiai reakciók vizsgálatára
5 174764 6 rendszerhez hozzáadott enzimmolekulák legnagyobb része az oldatban levő szubsztráttal reagál. A mérések egyúttal azt is jelzik, hogy létezik ilyen optimum. Az előbb ismertetett példában a szubsztrát a 3 884 896 számú USA szabadalmi leírásban ismertetett típusú polipeptid, amely érzékeny trombinra és más pepiid-hidroláz típusú proteolitikus enzimekre. Ez a szubsztrát hidrolizálódilc az enzim jelenlétében, miközben kromofór termék képződik, amelyet spektrofotometriásán lehet mérni. Ez a szubsztrát csak akkor optimális a leírt elektromos kimutatásra, ha igen jól kötődik az elektódokhoz és jelentős része leválik az elektródról az enzimatikus hidrolízis során, aminek következtében a fémelektródok kapacitása jelentősen megváltozik. Ezért a szubsztrátnak úgy kell kapcsolódnia, hogy az enzim által felbontandó kötése hozzáférhető legyen az enzim számára. A kísérletek azt mutatják, hogy a kimutatás optimumának eléréséhez nem szükséges, hogy a szubsztrát az egész felületet telítse. Az előbbi példában a szubsztrátumot a mérőberendezésben levő pufferoldathoz adjuk, azután a szubsztrát adszorbeálódik a fémelektródokon. Ennek az eljárásnak egy másik változata szerint az elektródokat már a mérés előtt bevonjuk egy szubsztrátum-réteggel, vagyis előzetesen preparált elektródokat használunk. A mérés során azt a kapacitásváltozást vizsgáljuk, amely akkor következik be, amikor ezeket az elektródokat bemerítjük az enzim oldatába. A szubsztrátumot tehát nemcsak adszopcióval, hanem például kémiai kötéssel is rögzíthetjük az elektród felületén. Az utóbbinak azonban az a feltétele, hogy a szubsztrát molekulák felbontandó kötése hozzáférhető legyen az enzim számára, és az, hogy a szubsztrát molekula egy része vagy teljes egésze szabaddá váljék, amikor az enzim megtámadja a molekulát. A 6. ábra egy olyan példát mutat, amikor a mérőberendezést antigén-antitest kötés kialakulásával járó immunológiai reakció vizsgálatára használjuk. Hasonlóképpen az előbbi példához a 2 és 3 elektródok közötti kapacitást az 1 impedanciahíddal mérjük, amelynek szerkezeti felépítése azonos az 1. ábrán bemutatott impedanciahídéval. Az elektródok felületei vagy kezdettől fogva preparálva vannak antigénnel, vagy pedig úgy járunk el, hogy az elektródokat az antigén oldatába merítjük, amikor is az antigén adszorbeálódik az elektródok felületére és akkor mérjük az elektródok kapacitását. Ezután az elektródokat antitesteket tartalmazó oldatba merítjük. Az antitestek az adszorbeált antigénekhez kötődnek, így az elektródok felületén levő réteg megnövekszik, következésképpen a C, kapacitás csökken. A 6a ábra szemlélteti a 4 pufferoldatba merített elektródokat. Amikor antigén molekulákat juttatunk a pufferba, (az ábrán S-sel jelölve) akkor az antigén molekulák addig adszorbeálódnak az elektródok felületén, amíg egyensúly áll be az oldatban levő és az elektródok felületére adszorbeálódott antigén között, amint azt a 6b ábra mutatja. Végül E antitesteket adunk a rendszerhez, amint azt a 6c ábrán szemléltetjük. Az antitestek egy része az oldatban levő antigénekhez kötődik, más részük az elektródok felületén levő antigénekhez. Végül itt is beáll az egyensúly, amint azt a 6c görbe mutatja. A 6d ábrán az elektródfelületek közötti soros Cj kapacitás van feltüntetve az idd függvényében, nevezetesen az antigének (S) és antitestek (E) hozzáadása után. A görbének az antitestek hozzáadása utáni kezdeti meredekségét az antitestek koncentrációja szabja meg, így az ennek kvantitatív fokmérője. Az antitestek koncentrációját meghatározhatjuk az antitestek hozzáadása után bekövetkező teljes kapacitásváltozásból is. Ebben a példában olyan antigéneket használhatunk specifikus szubsztrátként, amelyek molekulái úgy tapadnak az elektródokhoz, hogy az antitest molekulák hozzákapcsolódhassanak az antigén molekulákhoz, és az antigén-antitest réteg, amely ekkor képződik, kellő erősséggel kötődjön az elektódokhoz. Ha az antigénantitest komplex elszabadul az elektród felületéről, akkor ez az eljárás az előbbi példában leírtak szerint megy végbe. Még az antitestek meghatározásánál is létezik egy optimális antigén-koncentráció, amely az oldatban levő és az elektródok felületén levő antigének között kialakuló egyensúlytól, valamint a kötetlen és kötött antigén, illetve antitest molekulák közötti egyensúlytól függ. Ha a vizsgált anyag csupán az oldatban levő szubsztrátummal reagál, akkor az eljárást az alábbiak szerint hajtjuk végre. Ha olyan anyagot juttatunk a mérőberendezésben levő oldatba, amely csupán az oldatban levő szubsztrátummal reagál, akkor a szubsztrát molekuláinak koncentrációja csökken. Az egyensúly fenntartása végett az elektródok felületén adszorbeálódott szubsztrát leválik az elektródról, aminek következtében az elektród felületén levő réteg csökken, ugyanakkor megnövekszik a Cs kapacitás, amint azt a 7d ábra mutatja. Az időegységre eső kapacitásváltozás, vagyis a görbe meredeksége a vizsgált anyag hozzáadásának időpontjában az illető vegyület koncentrációjának függvénye, így azt kvantitatív módon jelzi. Ugyanezt mondhatjuk a hosszabb idő után bekövetkező teljes kapacitásváltozásról is, amelyet tehát a vizsgált anyag koncentrációjának vagy aktivitásának kiszámításához használhatunk. A rendszerhez hozzáadott anyag a legtöbb esetben mind az oldatban levő, mind az elektródokon levő szubsztráttal reagál. A kapacitásváltozás akkor két folyamattól függ, de ekkor is kvantitatív fokmérője a rendszerhez hozzáadott anyag koncentrációjának vagy aktivitásának. A találmány szerinti eljárás egyik legfontosabb felhasználási területe szerin-proteázok meghatározása. E célból szubsztrátként egy szerin-proteázokra specifikus szintetikus bontható polipeptidet használunk. Ez előnyösen egy R.-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CXJ-NH-Rs I I I r2 r3 (CH2)n-NH-R4 általános képletű vegyület vagy annak sója, ahol Rí hidrogénatomot, 1—12 szénatomos alkükarbonil-csoportot, 1—12 azénatomos egyenes láncú alkil-részt tartalmazó omega-amino-alkilkarbonü-csoportot, ciklohexil-karbonil-csoportot, 1—6 szénatomos egyenes láncú alkil-részt tartalmazó omega-ciklohexil-alkilkarbonil-csoportot,4-aminometil-ciklohexil-karbonil-csoportot, benzoil-csoportot, egy vagy több halogénatommal, metil-, amino- vagy fenil-csoporttal szubsz-3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
