174655. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tireotropint felszabadító hormon előállítására
3 174655 4 753 969 számú Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírás), tozil-csoporttal (2 119 966 számú NSZK-beli közre bocsátási irat) vagy benziloxi-csoporttal [ S. Bajusz, J. Fauszt, Acta chim. Hung. Z5 (4), 419 (1973)] védik. A bezil-védőcsoport lehasítása azonban igen hosszadalmas katalitikus hidrogénezéssel, a tozil-csoport lehasítása fluor-hidrogénes kezeléssel készülék szempontjából igen igényes és mellékreakciókhoz vezethet. Más eljárásoknál ezért kikerülik a hisztidin oldalláncának védelmét (2 033 600 számú NSZK-beli közre bocsátási irat), viszont a glutamin és/vagy prolinamid amid csoportját védik Mbh csoporttal. Ez az eljárásváltozat ugyan a jobb kristályosodási hajlam miatt javítja a közbenső termékek tisztításának lehetőségét, ugyanakkor a szintézis is igényesebb, mivel védőcsoportot kell bevezetni. Továbbá magas hőmérséklet szükséges az Mbh csoportok ezt követő lehasításához és az ehhez kapcsolódó piro-glutamilpeptid ciklizálásához. A találmány célja tehát olyan egyszerű és technikailag alkalmazható eljárás kidolgozása, amellyel jó termeléssel tiszta RTH-hoz jutunk. Ezért olyan eljárást kellett kidolgozni, ahol a védőcsoportok száma minimális, a kapcsolódási reakciók egyszerűek és a tisztítást kevés lépésben el lehet végezni. A találmány szerinti a di-terc-butiloxi-karbonilhisztidin (de-Boc-hisztidin) aktivált észterét, előnyösen di-Boc-hisztidin-p-nitrofenil-észtert prolinamiddal reagáltatjuk, valamely szerves oldószerben, előnyösen dimetilformamidban, 0-50 °C-nál, előnyösen 20 °C-nál. A keletkezett dipeptidet az oldószer eltávolítása és a Boc-védőcsoportok sósavval és jégecettel történt lehasítása után dihidrokloridként izoláljuk és aktivált piro-glutaminsav-észterrel reagáltatjuk. A dipeptid-dihidrokloridot a találmány szerint úgy izoláljuk, hogy a védőcsoport lehasítása után kapott olajat előnyösen éterrel digeráljuk és előnyösen metanollal vagy éterrel kicsapjuk, miközben a dipeptiddé kapcsoláskor felszabadult p-nitrofenolt eltávolítjuk. A dipeptid-dihidrokloridot önmagában ismert módon piroglutaminsav-pentaklór-fenil-észterrel (pGlu-OPcp) dimetilformamidban ekvivalens mennyiségű szerves bázis jelenlétében TRH-vá alakítjuk. A piro-glutamincsoportot más aktív észter, például 2,4,5-triklór-fenil vagy o-nitrofenil-észter felhasználásával is bevezethetjük. A reakciót az 1. reakcióvázlat szemlélteti: Boc-His(Boc)—ONp + H-Pro-NH2------> Boc-His(Boc)-Pro-NH2 + pGlu-OPcp l|f pGlu-His-Pro-NH2 ■«=--------------------- H-His-Pro-NH2 .2HC1 Si02 kromatogr. (TRH) (I) A találmány szerinti eljárásnak az ismert szintézisekhez képest számos előnye van: valamennyi szükséges kiindulási anyagot két lépcsős reakcióban állíthatjuk elő, (a piro-glutaminsavat közvetlenül a glutaminsavból is előállíthatjuk). A Boc-védőcsoport választása esetén a hisztidin N^amino-csőportja mellett egy lépésben a hisztidin oldallánca is védhető — ez feltétel a dipeptid jó kitermeléséhez. Ezt követőleg a Boc-védőcsoportok enyhe körülmények között sósav/jégecet kezeléssel lehasíthatók, anélkül, hogy szükséges volna a dipeptidet kromatográfiásan tisztítani. A találmány szerinti eljárás 60-65 %-os termeléssel teszi lehetővé a TRH előállítását (prolinamidra számítva). A találmányt a következő példával szemléltetjük; Példa a) Hisztidü-prolinamid-dihidroklorid (H-His-Pro-NH2 2HCI) H-Pto-NH2 1,14 g 10 mmól Boc-His(Boc-)-ONp 5,00 g 10,5 mmól dimetilformamid 15 ml A komponenseket dimetilformamidban oldjuk. 72 óráig szobahőmérsékleten keverjük az elegyet és az oldószert vákuumban ledesztilláljuk (fürdőhőmérséklet 45 ° C). A kapott szirupot 25 ml 2 n sósavas-jégecet elegyben oldjuk és 70 percig keverjük szobahőmérsékleten. Az oldatot 150 ml száraz éterhez csöpögtetjük és 3 óra hosszat állni hagyjuk. Az éterfázist dekán táljuk a kivált olajos dipeptid-dihidrokloridról és eltávolítjuk. Az olajat addig dörzsöljük el 50 ml éterrel amíg szilárd port kapunk. Az étert dekantáljuk. A terméket kétszer 50 ml éterrel jól eldörzsöljük, az étert minden alkalommal dekantáljuk, majd 20ml abszolút metanolban oldjuk és 150 ml abszolút éterrel kicsapjuk. Éterrel többször eldörzsöljük, majd a fent leírt módon szilárd anyagot kapunk, amelyről vákuumban rotációs bepárlóval eltávolítjuk az étert és 2 napig szárítjuk kálium-hidroxid fölött vákuumban. Termelés: 2,89 g fehér, erősen higroszkópos por (90%) a H—Pro—NH2 -re számítva. Vékonyréteg kromatográfiás vizsgálat alapján: Rf = 0,17 (Folie Silufol Kavalier, CSSR, n-butanol : jégecet : víz : etilacetát = 1 :1 :1 :1) Potenciometriás klorid meghatározás n/100 ezüst - nitráttal: számított: 21,7 % Cl talált: 21,3 % Cl MÔ5 =-59,5 (c = 1, víz). bj Piroglutamil-hisztidil-prolinamid (pGlu-His-Pro — NH2, TRH) H His-Pro-NH2.2HC1 2,86 g 8,9 mmól dimetilformamid 35 ml trietilamin (TEA) 2,5 ml 17,8 mmól piro-glutaminsav-pen- 3,6 g 9,5 mmól taklór-fenilészter (pGlu-OPcp) A dipeptid- dihidroklorid dimetilformamidos oldatához 0 “ C-ra hűtés után a megadott mennyiségű TEA-t és aktivált észtert adjuk. 72 óráig keverjük az slcpyct. A részben kivált TEA-HC1—t leszívatjuk és a szűrletet vákuumban 45 °C-os fürdő hőmérséklet mellett bepároljuk. A maradékot 5 ml kloroform es metanol elegyben = 2:1 oldjuk és 60 cm magas és 3 cm átmérőjű kovasav-oszlopra kloroform : metanol - 2 : 1 eleggyel egyenletesen felvisszük. Eluálási sebesség 40 ml/h, 10 ml-es frakciókat fogunk fel es vékonyréteg-kromatográfiásan megvizsgáljuk. Ezúton kloroform és metanol 2 :1 és kloroform és metanol i : 2 arányú elegyével eluáljuk. A csak TRH-t tartalmazó frakciókat egyesítjük és vízsugár vákuumban be-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
