174649. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új kalcitonin-származék előállítására
5 174649 6 amidometil-, benzil-, 3,4-dimetilbenzil-, p-metoxiben- esetben a karboxilcsoport észterezéssel védhető. A zil vagy tritilcsoporttal védjük. Az acetamidometil- vagy szerinben és treoninban a hidroxilcsoport szükség tritil-csoportot a védett pepiidről higany (II) -acetáttal és hidrogénszulfiddal szerves oldószerben reagáltatva távolítjuk el, és a benzil-, 3,4-dimetilbenzil- vagy p-metoxibenzil-csoportot nátriummal vagy hidrogénfluoriddal cseppfolyós ammóniában reagáltatva szelektíven távolíthatjuk el. A találmány szerinti eljárást előnyösen úgy hajtjuk végre, hogy az 1. aminosavtól a 7. vagy 12. N-terminális aminosavakból álló, N-terminális peptidfragmenssel kondenzáljuk a többi, 8.-32., 9.-32., 10.-32., 11.-32., 12.-32., illetve 13.-32. aminosavakból álló szekvenciánál. Az említett, az 1.-től a 7.-12. N-terminális aminosavakból álló N-terminális peptidfragmens a 23. aminosavig teijedő fragmenssel is kondenzálható, és az így kialakított tetrakozapeptid a 24.-32. aminosavakból álló nonapeptiddel kondenzálható. Az említett kondenzációs reakciót az azidos módszerre] hajtjuk végre, és azid- vagy hidrazid-végcsoportot tartalmazó pepiidből indulunk ki. Előnyösen olyan módszerrel is dolgozhatunk, amelyben szabad karboxil-terminális pepiidből indulunk ki, ilyen az úgynevezett Wünsch-féle módszer, vagy az ehhez hasonló módszerek. Ugyanilyen eljárással állíthatjuk elő az 1.-7. aminosavakból álló heptapeptid, az 1.-8. aminosavakból álló nonapeptid, az 1.-10. aminosavakból álló dekapeptid, oktapeptid, az 1—9. aminosavakból álló nonapeptid, az 1—10. aminosavakból álló dekapeptid, az 1—11. aminosavakból álló undekapeptid vagy az 1—12. aminosavakból álló dodekapeptid N-terminális fragmenseket. A dekapeptid szekvenciát úgy állíthatjuk elő, hogy az 1.-5. aminosavakból álló szekvenciát a 6.-10. aminosavakból álló szekvenciával vagy az 1.-6. aminosavakból álló szekvenciát a 7.-10. aminosavakból álló szekvenciával vagy az 1.-4. aminosavakból álló szekvenciát az 5—10. aminosavakból álló szekvenciával kapcsoljuk össze. Erre a szintézisre természetesen a különféle aminosav-szekvenciákból álló egyéb peptidfragmensek is felhasználhatók. Például az említett peptidet az első aminosavegységnek a 2.-10. aminosav-szekvenciával való kondenzációjával állíthatjuk elő. A fragmenseket úgy állíthatjuk elő, hogy az aminosav- egységeket és/vagy kevés aminosavból álló peptid-egységeket a C-terminálisnál kapcsoljuk az 1 képlet által meghatározott aminosav-sorrendbe. A ciszteinben az a-aminocsoportot védő csoport előnyösen savas hidrolízissel lehasítható csoport, például terc-butoxikarbonil- csoport lehet. Ugyanezen reakcióban hasad le előnyösen a merkaptocsoport védőcsoportja. Ilyen védőcsoport például az acetamidometil-, benzil-, 3,4-dimetilbenzil-, p-metoxibenzilvagy tritilcsoport. Az aziddel, aktív észterrel vagy savanhidriddel végrehajtott kondenzáció alkalmazásakor a dekapeptid karboxil-végcsoportját nem szükséges védeni. A karboxilcsoportot például metanollal, benzilalkohollal vagy más alkohollal végzett észterezéssel is védhetjúk. Az észtercsoportot, például metilésztercsoportot híg nátriumhidroxid-oldattal távolíthatjuk el, vagy úgy, hogy hidraziddá alakítjuk, a benzilésztercsoportot pedig katalitikus hidrogénezéssel távolíthatjuk el. A közbenső termék aminocsoportját szokásos védőcsoportokkal, például benziloxikarbonil-, tritil-, terc-butoxikarbonil- vagy 2-p-difenil-izopropoxikarbonil-csoporttal védhetjúk. Kívánt esetén észterezéssel védhető, és erre a célra terc-butanolt, benzilalkoholt vagy más alkoholt használhatunk. 5 Az említett benziloxikarbonil-, p-nitrobenzilészter- és benzilészter-csoportokat palládium-szén jelenlétében katalitikus hidrogénezéssel távolítjuk el. Az N-tritilcsoportot vizes ecetsavval és a terc-butoxikarbonilcsoportoí trifluorecetsawal hasítjuk le. Az o-nitrofe- 10 nilszulfenil-csportot szerves oldószerben hidrogén-kloridot, hidrogéncianidot vagy kénsavat használva hasíthatjuk le. A difenil-izopropoxikarbonil-csoportot 7:1:2 arányú ecetsav-hangyasav-víz eleggyel távolítjuk el. A metilészter-, etilészter- vagy p-nitrobenzilészter- 15 csoportot hidrazinhidráttal hidraziddá alakítjuk. A metilésztercsoportot híg nátriumhidroxid-oldattal és a terc-butilésztercsoportot trifluorecetsawal hasíthatjuk le. Az S-tritilcsoportot higany (II) acetáttal és hidrogénszulfiddal reagáltatva távolítjuk el. Az S-ben- 20 zilcsoportot és, ha jelen van, ugyanakkor a p-nitrobenzilészter-csoportot cseppfolyós ammóniában nátriummal hasítjuk le. A diszulfid hídkialakítását a korábban leírt oxidációs módszerrel hajthatjuk végre. Azokat a 8.-13.-tói 32-ig teijedő aminosav-szekven- 25 ciából álló terminális peptideket, amelyeket a fenti N-terminális peptiddel kondenzálunk, előnyösen úgy állítjuk elő, hogy a 17.-32. szekvencia C-terminális fragmensét a 8.-16., 9.-16., 10.-16., 11.-16., 12.-16. vagy 13.-16. szekvenciával kapcsoljuk. Az említett 30 peptidet előnyösen úgy is szintetizálhatjuk, hogy a 32. C-terminális aminosavat vagy egy C-terminális peptidfragmenst, például a 31.-32., 29.-32. vagy 27.-32. vagy 26.-32., 25.-32. vagy 24.-32. aminosav-szekvenciát egy aminosavval vagy kettő-négy amino- 35 savat a maradék aminosavak sorrendjében tartalmazó kevés aminosavból álló pepiiddel kondenzáljuk. Például a 11.-32. aminosavakból álló C-terminális peptidfragmenst úgy állítjuk elő, hogy egy aminosavat, például glicint, prolinamidot, treonint, aszparaginsa- 40 vat, arginint, glutamint vagy glutaminsavat és egy kevés aminosavból álló peptidet, például a 29.-30. vagy 27.-28. dipeptidet, a 21.-23. tripeptidet, 16.-19. tetrapeptidet, és 11.-13. tripeptidet a C-terminálistól számított aminosav-szekvencia sorrendjében aktív ész- 45 teres módszerrel vagy Geiger-módszerrel kondenzáljuk. Mindegyik csoportot előnyösen a következő védőcsoportok egyikével védjük: a-aminocsoportot terc-butoxikarbonil-csoporttal, oldallánc karboxilcsoportot benzilésztercsoporttal, e -aminocsoportol 50 o-klórbenziloxikarbonil- vagy diizopropilmetoxikarbonil-csoporttal, a szerin, tréonin és tirozin hidroxilcsoportját benzilcsoporttal, és az arginin guanidincsoportjának aminocsoportját és a hisztidin iminocsoportját tozilcsoporttal védjük. 55 A 8.-13.-tói 16-ig teijedő aminosav-szekvenciából álló C-terminálist tartalmazó fragmenst úgy állíthatjuk elő, hogy a 8.-13., 9.-13. vagy 10.-13. aminosav-szekvenciát kondenzáljuk a 14.-16 aminosav-szekvenciával: vagy a 8.-12., 9.-12., vagy 10.-12. aminosav- 60 -szekvenciát a 13.-16. aminosav-szekvenciával kondenzáljuk. Az így kapott fragmenst használjuk a további aminosav-szekvenciával, például a fent ismertetett hexadekapeptiddel vagy ennek egy fragmensével való kondenzációra. A glutaminsavban a 7-karboxilcsopor- 65 tot terc-butilésztercsoporttal és a lizinben az e-aminocsoportot előnyösen terc-butoxikarbonil-csoporttal védhetjúk. A szerinben a hidroxilcsoportot terc-buti-3
