174649. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új kalcitonin-származék előállítására
25 174649 26 port kapunk. 393 mg ilyen port 1 ml 0,1 n ecetsavban oldunk, és Sephadex G-50 gyantával töltött, 3,0 cm átmérőjű 107 cm hosszú oszlop tetejére töltjük, és óránkint 10 ml eluátum sebességgel 0,1 n ecetsavval eluáljuk. A biológiai kísérlettel meghatározott aktív frakciókat egyesítjük, és liofilizálva 267 mg poralakú aktív anyagot kapunk. Az aktív port 1 ml 0,1 n ecetsavban feloldjuk, az oldatot 0,01 mólos ammóniumacetátban karboximetil-cellulózzal töltött 2,0 cm átmérőjű 20 cm hoszszú oszlopra visszük fel, majd 500 ml 4,5 pH jú 0,01 mólos ammóniumacetáttal kezdve, 500 ml 4,5 pH-jú 0,15 mólos ammóniumacetátig fokozatosan eluáljuk, és 6,7 ml-es frakciókat szedünk. A biológiai meghatározással aktívnak talált 109.-126. frakciókat egyesítjük, és liofilizáljuk, mire a terméket fehér por alakjában kapjuk. 18 mg ilyen port kevés 0,1 mólos ecetsavban feloldunk, és az oldatot Sephadex LH-20 gyantával töltött 2 cm átmérőjű 75 cm hosszú oszlopra öntjük, 0,1 mólos ecetsavval eluáljuk, 5 ml-es frakciókat szedünk, és a 13.-17. aktív frakciókat liofilizálva aktív port kapunk. Rf = 0,65 - 0,71. { a ]2° = -75° (c=l, 0,1 n hangyasav). Hatékonysága 4200 MRC egység/mg. Aminosavelemzés: Cys/2 2,07(2), Ser 2,84 (3), Leu 5,15(5), Thr 3,50(4), Val 2,18(2), Gly 3,00 (3), Lys 1,95(2), Glu 3,30(3), ffis 0,96(1), Tyr 0,91(1), Pro 1,97 (20, Arg 1,04(1), Asp 2,05(2), Ala 0,98(1). A kiindulási anyagot a következőképpen állítjuk elő: A [11—32.] aminosavak egymásutánjából álló rész: BOC-Lys(ClCbz)-Leu-Ser(Bzl)-Gln-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(T os)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl) -Val -Gly -A1 a-Gly - -Thr(Bzl)-Pro-NH2 a) BOC-Lys(ClCbz)-Leu-OEt Etilacetátban szuszpendáit 7,32 g BOC-Lys(ClCbz)-OH.terc-butilaminsót háromszor 100 ml n sósavval, majd 100 ml vízzel mossuk, vízmentes magnéziumszulfáton szárítjuk, és az etilacetátot ledesztilláljuk. A maradékhoz 60 ml diklórmetánt, 2,93 g H-Leu-OEt.HCl-t és 2,0 g 1-hidroxibenzotriazolt adunk, majd — 5°-on hűtés közben 2,75 ml N-etil-N’-dimetilaminopropil-karbodiimidet adunk hozzá, 1 óra hosszat ezen a hőmérsékleten, és éjjelen át szobahőmérsékleten keverjük. A reakció befejeződése után a diklórmetánt vákuumban ledesztilláljuk, és a maradékot 150 ml etilacetátban feloldjuk. Az oldatot n sósavval, 5 %-os vizes nátriumhidrogén-karbonát oldattal és végül vízzel mossuk, vízmentes magnéziumszulfáton szárítjuk, és vákuumban bepároljuk. A maradékot etilacetát és n-hexán elegyéből átkristályosítva 6,4 g (76,6 % kitermeléssel) BOC-Lys(ClCbz)-Leu-OEt-t kapunk. Olvadáspontja 76-97°. b) BOC-Lys(Cl€bz)-Leu-OH 6,13 g BOC-Lys(ClCbz)-Leu-OEt 20 ml etilacetáttal készült oldatához 0°-on hozzáadunk 12J ml n nátriumhidroxid- oldatot. 2 óra hosszat szobahőmérsékleten való keverés után további 1,1 ml n nátriumhidroxid-oldatot adunk hozzá, 1 óra hosszat tovább keverjük, majd a pH-t 7-re állítjuk be, és a reakciókeveréket vákuumban bepároljuk. A maradékot dietiléterrel mossuk, a vizes réteg pH-ját 3-ra állítjuk be, és háromszor 100 ml etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos réteget 100 ml vízzel mossuk, vízmentes nátriumszulfáton szárítjuk, és vákuumban bepároljuk. A maradékot 50 ml dietiléterben oldva, csökkentett nyomáson bepárolva és szárítva, 5,85 g por alakjában BOC-Lys(ClCbz)-Leu-OH-t kapunk. Olvadáspontja 46-60° fölött van. [ a ]'® = -10,68° (c=I, dímetilformamid). c) BOC-Leu-His-OH 3,83 g H-His-OH.HCl-t melegítés közben 25 ml vízben oldunk, majd szobahőmérsékletre hűtjük, és 1,84 g nátriumhidrogénkarbonátot, majd 270 mg 1-hidroxibenzotriazolt, 8,5 g BOC-Leu-OSU-t és 25 ml tetrahidrofuránt, végül 10 ml vizet adunk hozzá, és éjjelen át szobahőmérsékleten keverjük. A reakciókeverék pH-ját ezután nátriumhidrogén-karbonát-oldattal 7-re állítjuk be, és 1,3 g BOC-Leu-OSU-t adunk hozzá, 6 óra hosszat keverjük, majd további 13 g BOC-Leu-OSU-t adunk hozzá, és a keverést éjjelen át tovább folytatjuk. A reakció befejeződését vékonyrétegkromatografálással ellenőrizzük, és a reakciókeverékből az oldószert vákuumdesztillációval eltávolitva a visszamaradt vizes réteget etilacetáttal mossuk. A vizes réteg pH-ját 5-re állítjuk be, és HP-20 gyantával töltött, 2,3 cm átmérőjű 18 cm hosszú oszlop tetejére öntjük, majd az oszlopot vízzel addig mossuk, amíg a vizes eluátum ninhidrinnek negatív reakciót nem mutat. Ezután metanollal eluálunk, az eluátumot vákuumban bepároljuk, és a maradékhoz dietilétert adunk. A keletkezett csapadékot szűréssel elválasztjuk, majd kétszer metanol és dietiléter elegyével újra leválasztva és szárítva 3,94 g (53,5 %) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspontja 178-180°. [ a = -0,19° (c=l, dimetilformamid). d) BOC-Leu-Ser(Bzl)-OH 11,7 g H-Ser(Bzl)-OH 50 ml vízzel készült oldatához hozzáadunk 10,1 g nátriumhidrogénkarbonátot és 10 ml dioxánt, majd 15 ml dioxán és 5 ml dimetilformamid elegyében oldott 16,4 g BOC-Leu-OSU-t. A reakciókeveréket éjjelen át keveijük, majd pH-ját 7-re állítjuk be, és a szerves oldószereket vákuumdesztillációval eltávolítjuk. A vizes réteget 100 ml etilacetáttal kirázzuk, és a szerves réteget kétszer n sósavval, majd vizzel mossuk. A szerves réteget vízmentes magnéziumszulfáton szárítjuk, vákuumban bepároljuk, és a maradékot etilacetát és n-hexán elegyéből kétszer átkristályosítva 16,1 g (78,8 %) BOC-Leu- Ser(Bzl)-OH-t kapunk. Olvadáspontja 82—86°. e) BOC-Lys(ClCbz)-Leu-Ser(Bzl)-OH A d) pont szerint előállított 4,1 g (10 mmól) BOC-Leu-Ser(Bzl)-OH-t -5°-on hűtve hozzáadjuk 25 ml trifluorecetsavhoz, az oldatot 25 percig keverjük, majd vákuumban bepároljuk. A maradékhoz dietilétert adunk, és a kivált terméket vákuumban nátriumhidroxidon szárítjuk. A kapott kristályokat 8 ml dimetilformamidban oldjuk, az oldathoz 8 g BOC-Lys(ClCbz)-ONP-t és 270 mg 1-hidroxibenzotriazolt adunk, a pH-t N-metilforfolinnal 8-ra állítjuk be, majd éjjelen át szobahőmérsékleten keveijük. Ezután a reakciókeverékhez n sósavat adunk, a kivált csapadékot kloroformban oldjuk, és az oldatot háromszor n sósavval, háromszor 5 %-os vizes nátriumhidrogénkarbonát-oldattal és háromszor vízzel mossuk. A kloroformos réteget vízmentes magnéziumszulfáton szárítva, vákuumban bepároljuk. A maradékot háromszor etilacetát és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
