174276. lajstromszámú szabadalom • Eljárás oldhatatlan biológiailag aktív fehétjék előállítására
5 174276 6 dunk, majd 1 g szálasanyagot keverve bele a pH-t 0,3 mólos NH4OH oldattal pH: 7,5-on tartjuk. A teljes kötés ideje kb.: 6 óra, mely idő alatt 14 ml 0,3 mólos NH4OH fogy. A szálas anyagot az enzimoldatból kiemelve 20 ml 0,1 mólos 7,5 pH értékű foszfátpufferrel, majd 2 x 20 ml 1 mólos NaCl-dal és 2 x 20 ml desztillált vízzel mossuk, a mosófolyadékot térfogatra és aktivitásra méijük. A penicillin aciláz aktivitás mérését Svatek módszerével [Biochim. Biophys. Acta 276(1972) 250—252] végeztük. Az oldhatatlan enzim aktivitásának mérése, 100 ml 1%-os C-penicillin tartalmú oldatban történt keverés mellett. Az enzimmegkötés mértéke az oldhatatlan enzimről visszamérve 60 mg/g. 2. példa Mindenben az 1. példa szerint járunk el azzal a különbséggel, hogy polietilén szálasanyagot polimerizálunk. A Penicillin aciláz kötés mértéke az oldhatatlan enzimről visszamérve 60 mg/g. 3. példa Mindenben az 1. példa szerint járunk el azzal a különbséggel, hogy a monomerek arányát a hidrofil alkotórész javára megváltoztatjuk, tehát a 20 rész maleinsavanhidrid-metakrilsav-stirol-divinilbenzolt tartalmazó monomeres fürdő összetétele: 9,8 rész maleinsavanhidrid, 9,0 rész metakrilsav, 1,0 rész stirol, 0,2 rész divinilbenzol 60 rész benzolban. Az ojtáskonverzió: 21 ± 5%. Az összes karboxil tartalom 3,2 mval/g. Az enzimmegkötés mértéke az oldhatatlan enzimről visszamérve: 66 ipg/g. 4. példa A nagyenergiájú sugárzással peroxidált 1 súlyrész polipropilén szálasanyagot (0,75% peroxidtartalom) 37,5 súlyrész maleinsavanhidrid-vinilacetát-divinilbenzol tartalmú monomerfürdőbe helyezzük. A monomerfürdő összetétele: 20 rész maleinsavanhidrid, 17,2 rész vinilacetát és 0,3 rész divinilbenzol 10 rész benzolban. A reakcióhőmérséklet 84 °C, a reakcióidő 4 óra. Az ojtáskonverzió 25± 5%. A maleinsavanhidrid tartalom (COOH)2 = 2,8 mval/g. A bekötést az 1. példa szerint végezzük tripszinnel. A tripszin aktivitás mérése észteráz aktivitás mérésen alapul, pH - stat módszerrel, benzol - L - axiginin - etÜészter és 5%-os kazein szubsztráttal. Tripszin: 1U = 1 mól szubsztrátbontás 26°C-on pH: 7,8-on 1 perc alatt. Az enzimmegkötés mértéke az oldhatatlan enzimről visszamérve 30 mg/g. 5. példa Mindenben a 4. példa szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a kovalens kötést lúgos proteázzal végezzük. Az enzimmegkötés mértéke az oldhatatlan enzimről visszamérve 35 mg/g. 6. példa Mindenben az 1. példa szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy 1 g ovalbumint kötünk 1 g mólos anyaghoz. A megkötés mértéke 70 mg/g. A fehéijemeghatározás Biuret-módszerrel történik indirekt módon. 7. példa Az 1. példa szerint előállított hordozó lOg-jához 5 g penicillin acilázt kötve (0,25 E/mg), a kötés után visszamért aktivitás 150E/10g hordozó. 3% G-penicillin Na-sót (GPNa) tartalmazó 0,1 mólos pH 8-as foszfátpuffer 350 ml-be (10,5 g 350 ml) helyezzük az elkészített szilárd enzimet 37 °C hőmérsékleten állandó keverés mellett. A keletkező 6-aminopenicillánsav közömbösítésére trietilamint adagolunk folyamatosan a rendszerbe, ezzel a pH-t 7,5—8,0 értékek között tartjuk. A mintákat óránként vesszük, a keletkező 6-aminopenicillánsavat Biochim. Biophis. Acta 276/1972 250—256 old. található Svatek módszer szerint határozzuk meg. A felhasználások során az adott specifikus aktivitású enzim esetén 7 órás konverziós idő szükséges. 1. Felhasználásnál a konverzió: 100% 20. Felhasználásnál a konverzió: 96% 25. Felhasználásnál a konverzió: 96% 28. Felhasználásnál a konverzió: 94% 30. Felhasználásnál a konverzió: 90% 32. Felhasználásnál a konverzió: 80% 8. példa Az 1. példa szerint előállított 1 g hordozóhoz 600 mg penicillin acilázt kötünk (0,14 E/mg). A visszamért aktív kötés 8,4 E/g. 20 ml pH: 6-os 0,1 mólos foszfátpufferben 40 mg 7-aminocefalosporán savat oldunk 0,1 M NaOH-al segítve a sóképzést. pH: 6-on. 320 mg fenilglicm-metilésztert oldunk az oldatba 37 °C-on. A szilárd enzimet betéve megindítjuk a reakciót, állandó üvegkeverős keverés mellett. A mintavétel két óránként történik. Kémiai szintézissel készült cefalexin standardhoz viszonyítva mértük a keletkező cefalexint B. subtilis lemezen. A reakcióelegy kontroll figyelembevételével az alábbi értékeket kaptuk: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
