174263. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szerin proteázok meghatározására, valamint a meghatározáshoz használható kromogén enzim-szubsztrátok előállítására
13 174263 14 E szubsztrátok gyakorlati hasznát növeli, hogy e vegyületek alkalmasak a plazma X faktorának meghatározására is. A vér palazmájában levő X faktort a meghatározáshoz előbb akvitálni kell. A két lépéses eljárásban először Russel-féle kígyóméreggel (Russel’s Viper Venom - RVV) aktiváljuk a meghatározandó enzimet, azután az 1. példa szerinti szubsztráttal elvégezzük a meghatározást. 15/aliter citrátos plazmát 410 ml pufferral (0,05 mól/liter trisz puffer, pH 8,3, I 0,25) hígítunk. Hozzáadunk 25 /aliter 0,5 mól/liter töménységű kalciumklorid (CaCl2 ) oldatot és 50 /aliter 0,12 g/liter töménységű RW oldatot, azután a keveréket 60 másodpercig inkubáljuk. Ezután összekeverjük 1,5 ml pufferrel, hozzáadjuk az 1. példa szerinti szubsztrát 4 • 10“3 mól/liter töménységű oldatának 0,5 ml-ét, amikor is az össztérfogat 2,5 ml lesz. Az összekeverés után spektrofotometriásán meghatározzuk az aktivitást 405 nm-nél, és összehasonlítjuk egy standard görbével. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás szerin proteázok, különösen az Xa faktor diagnosztikai meghatározására, azzal jellemezve, hogy a vizsgálandó enzimet valamely Rj —Aj —A2 —Gly—Arg—NH—R2 általános képletű vegyülettel, ahol Rí hidrogénatomot, 1-4 szénatomos alkanoil-csoportot vagy benzoil-csoportot, R2 p-nitrofenil-, naftil- vagy 4-metoxinaftil-csoportot jelent, A] jelentése egyszeres kötés vagy egy Gly-, Val-, Leu-, lieu-, Pro-, Phe- vagy Tyr-csoport és A2 jelentése Glu-, Gin-, Asp- vagy Asn-csoport, és valamennyi optikailag aktív csoport L-konfigurációjú, reagáltatjuk, a reakció során felszabaduló R2-NH2 általános képletű vegyületet, ahol R2 5 jelentése a fenti, fotometriás vagy spektrofotometriás úton önmagában ismert módon meghatározzuk, és a mérési adatokból kiszámítjuk a szerin proteáz mennyiségét. 2. Eljárás szerin proteázok meghatározásához, 10 különösen az Xa faktor diagnosztikai meghatározásához kromogén szubsztrátként használható Rí-A!-A2-Gly-Arg-NH-R2 általános képletű vegyületek és sóik előállítására, ahol R! hidrogénatomot, 1—4 szénatomos alkanoil-csoportot vagy 15 benzoil-csoportot, R2 p-nitrofenil-, naftil- vagy 4-metoxinaftil-csoportot jelent, A! jelentése egyszeres kötés vagy egy Gly-, Val-, Leu-, lieu-, Pro-, Hie- vagy Tyr-csoport és A2 jelentése Glu-, Gin-, Asp- vagy Asn-csoport, és valamennyi optikailag 20 aktív csoport L-konfigurációjú, azzal jellemezve, hogy a) arginint egy R2—NH2 általános képletű vegyülettel, ahol R2 jelentése a fenti, reagáltatunk, 25 és a hiányzó aminosavakat, illetve karbonsavat a helyes sorrendben, önmagában ismert módon összekapcsoljuk a kapott vegyülettel, vagy b) a megfelelő, kívánt esetben szokásos védőcsoportokat tartalmazó aminosavakat, karbonsavat, il-30 letve peptid-fragmenseket a helyes sorrendben, önmagában ismert módon összekapcsoljuk egymással, azután a védőcsoportokat eltávolítjuk, és a kapott peptid-molekulát egy R2-NH2 általános képletű vegyülettel, ahol R2 jelentése a fenti, reagáltatjuk. A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 804497 - Zrínyi Nyomda, Budapest 7
