174149. lajstromszámú szabadalom • Eljárás emberi albumin előállítására
9 174149 10 Minthogy a fenti oldat proteintartalma csekély volt, az oldatban levő proteineket ismét csapadék formájában gyűjtjük össze egyszerűen azáltal, hogy az oldatot megsavanyítjuk. Ha a polietilénglikol koncentráció 20% vagy annál nagyobb, a keresett proteinek kicsaphatok, ha a pH-t 4,5—5,6 közé állítjuk. A csapadékot dehidratálással elkülönítve, olyan tisztított plazma proteint kapunk, amely fő összetevőként sem csoportanyagot, sem vérnyomáscsökkentő anyagot nem tartalmazó albuminból áll. A kapott csapadékot lázkeltő anyagoktól mentes desztillált vízben oldjuk, és elektroforetikusan analizáljuk. A protein összetételére a következőket kaptuk: 95—98% albumint és 2—5% a-globulin és ß-globulin. Az ultracentrifugálásos analízis csak az albumin-csúcsot mutatta, ami tiszta protein jelenlétére utal. A kapott tiszta protein semmi jelét nem mutatja sem a szennyezésnek mint például csapadékképződés vagy zavarosság megjelenése. Egereknek, tengerimalacoknak, nyulaknak vagy kutyáknak beadagolva mérgezés nem mutatkozik, sem olyan kedvezőtlen tulajdonságok, mint például csoportanyag aktivitás kifejlődése, vagy vérnyomáscsökkenés. A plazma protein kitermelése a fenti eljárás során 2,3 g placentánként. 2. példa A placenta extraktum kezelésére vonatkozó és az első példában leírt eljárást követve fő alkotóként albumint tartalmazó plazma protein állítható elő retroplacentás vér szérumból, vagy hemolizált vénás vérből, mint kiindulási anyagból. A kitermelés 1 liter retroplacentás szérumból 11 g, illetve hemolizált vénás vérből 17 g. 3. példa Az első példában leírt eljárást megismételve azzal a különbséggel, hogy az EDTA-at 1 mmól koncentrációban adjuk az oldathoz abban a fázisban, amikor a mandulasavat 4% végső koncentrációban már hozzáadtuk. Az oldatot ezután 58—60°C-on tartjuk körülbelül 1 óráig és közben az oldat savanyú kémhatásáról gondoskodunk (pH 4,5—5,5). A többségében albumint tartalmazó plazma protein, melyet az eljárás során kapunk, teljesen mentes nemcsak a csoport anyagoktól, hanem vérnyomáscsökkentő anyagoktól és a hemoglobintól is, úgyszintén az alkalikus foszfatáztól. Az alkalikus foszfatáz enzimatikus aktivitását a Journal of Biological Chemistry-ben leírt módon [Vol. 164, p. 321 (1946)] határozhatjuk meg. 4. példa A humán albumint az alábbiak szerint nyerjük ki retroplacentás vérből. A placenta elválasztása után végzett vérvétel során esetenként mintegy 200 ml emberi vért kapunk. Ezt egy olyan edénybe töltjük, amelyben antiszeptikus és koaguláló anyagként előzetesen 2 ml 3%-os akriflavin oldatot helyeztünk el. Ezután a hematocitát elválasztjuk, a kapott szérumot bet öltjük egy higiénikus műanyag-palackba és —20 °C-on fagyasztva tároljuk. Az előbbiek szerint elkülönített retroplacentás szérumot kórházakból gyűjtjük, majd mintegy 250 liternyi mennyiség begyűjtése után az egészet összekeverjük és hozzáadunk ugyanakkora térfogatú 0,9%-os nátriumklorid-oldatot. A hígított retroplacentás szérum pH-ját 4,8-ra állítjuk be, és a szérumot a mucoprotein frakció eltávolítása végett centrifugáljuk. A felső folyékony fázishoz ammóniumszulfátot adunk, 1 Éterhez 327 g-ot, amikor is a pH 6,5—7,5-re áll be és kicsapódik a gammaglobulin frakció. A felső folyékony fázisban nagy mennyiségű hemoglobin, albumin és vércsoport anyag marad. Mivel ebben a folyadékban kicsi a proteinek koncentrációja, literenként 223 g ammóniumszulfátot adunk a folyadékhoz. Ekkor a pH 6-7-re áll be és kicsapódik az összes protein. A kapott csapadékot az 1. példában leírt módon dolgozzuk fel, amikor is túlnyomórészt albumint tartalmazó fehérje-oldatot kapunk. Az így kapott fehérje-oldatot elektroforézissel vizsgáltuk. A fehérjék 97—98%-a albumin, 2—3%-a a-globulin és 0-globulin volt. Semmiféle denaturálódást, csapadékképződést vagy zavarosságot nem tapasztaltunk a fehérjén. Megállapítottuk továbbá, hogy egérre, tengeri malacra, nyúlra és kutyára nem toxikus, és egyéb hátrányos tulajdonságoktól is mentes: csoportanyag-aktivitás nem alakul ki és nem okoz vérnyomásemelkedést. 1 liter retroplacentás szérumból ezzel az eljárással mintegy 11 g plazma-proteint kaptunk. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás emberi albumin előállítására, azzal jellemezve, hogy vércsoport anyagot tartalmazó, emberi placentából vagy retroplacentás vérből származó albumin vizes oldatához 6,6 és 9,6 közötti pH-nál a vizes oldat össztérfogatára számítva 13—30% (súly/térfogat) polietilénglikolt adunk, a kicsapódó szennyező proteineket, melyek az említett vércsoport anyagokat is tartalmazzák, elkülönítjük, és a visszamaradt oldatból az albumint kivonjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy olyan vizes albumin oldatot használunk, amely az összes proteinre számítva legalább 50% albumint tartalmaz. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a szennyezések kicsapására olyan polietilénglikolt használunk, amelynek átlagos molekulasúlya 2000 és 10000 között van. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
