174137. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A—22082 jelű polipeptid antibiotikum előállítására
9 174137 10 Az Aspergillus nidulans NRRL 8112 jelű törzszsel beoltjuk a ferdeagart, és körülbelül 7 napig 25° C-on inkubáljuk a beoltott ferdeagart. Marhaszérummal fedjük az érett ferdeagar-tenyészetet, és a spórák fellazítása céljából steril kaccsal felkapargatjuk. Hat tablettává fagyasztva szárítjuk az ily módon nyert szuszpenziót. Egy a fenti módon nyert tablettával 50 ml, a következő összetevőket lajt oltunk be: tartalmazó vegetatív táptaösszetevő Mennyiség (%) Glükóz 1,0 Glicerin 1,0 Gyapotmagliszt 2,5 Kalcium-karbonát 0,1 Víz 95,4 Egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban 48 órán át 25° C-on tartjuk a beoltott vegetatív táptalajt egy 5 cm átmérőjű ív mentén percenként 250-et forduló rázóasztalon. B) Az A—22082 jelű antibiotikum előállítása az Aspergillus nidulans NRRL 8112 tartályfermentorban végzett tenyésztése útján. Nagyobb térfogatú inokulum előállítása céljából a fent leírt módon nyert inkubált vegetatív közeg 10 ml-nyi mennyiségével egy a vegetatív táptalajjal azonos összetételű, második fokozatú vegetatív táptalaj 200 ml-nyi térfogatát oltjuk be. Egy 2 literes szélesszájú Erlenmeyer-lombikban 48 órán át 25 C-on tartjuk ezt a második fokozatú táptalajt egy 5 cm átmérőjű ív mentén percenként 250-et forduló rázóasztalon. A fent leírt módon nyert inkubált másodikfokozatú vegetatív táptalaj 800 ml-nyi mennyiségével a következő összetételű csíramentes termelő táptalaj 100 liternyi mennyiségét oltjuk be: összetevő Mennyiség (%) Szacharóz 2,0 Maltóz 1,0 Malátakivonat 1,0 Melasz 0,5 Kukoricalekvár 0,5 Enzimesen hidrolizált kazeinx 0,5 Víz 94,5 XN-Z-Case, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y. Autoklávban, 120° C-on, 3-4 atm nyomás mellett 30 percig végzett csíramentesítés után a közeg pH-ja 7,1. 5 napon át 25° C-os hőmérsékleten fermentáljuk a beoltott termelő táptalajt egy 165 literes tartályfermentorban. Percenkét 0,4 térfogatszázalék csíramentes levegő bevezetésével levegőztetjük a fermentációs elegyet, és percenként 250-et forduló hagyományos keverővei kevertetjük. 2. példa Az A-22082 jelű antibiotikum kinyerése Az 1. példában leírt módon nyert, 200 liter térfogatú teljes táptalajt (A-22082 tartalom : 56 mcg/ml) szűrési segédanyag (Hyflo Super-cel, egy diatómaföld-fajta, Johns-Manville Products Corp.) segítségével megszűrjük. 100 liter metanollal extraháljuk az elkülönített micéliumot. Csökkentett nyomáson 50 liter térfogatra betöményítjük a metanolos extraktumot. Sósav hozzáadásával 3,5— —4,0 pH-értékre savanyítjuk a metanolos sűrítményt. Az ily módon nyert oldat térfogatára számított fele mennyiségű kloroformmal kétszer kirázzuk az oldatot. Egyesítjük a kloroformos extraktumokat, és 1 liternyi térfogatra betöményítjük. 100 ml acetonitrilhez adjuk a sűrítmény egy 250 ml-nyi mennyiségét. Szűrjük az így nyert oldatot, és csökkentett nyomáson 150 ml térfogatra betöményítjük a szűrletet. Szilikagéllel töltött oszlopra (5,5 x 54 cm, Woelm szilikagél) visszük fel ezt a betöményített szűrletet. 5 ml/perc sebességgel acetonitril és víz 97 :3 arányú elegyével eluáljuk az oszlopot, 10 ml térfogatú frakciókat szedünk. Szilikagél lemezekkel végzett vékonyrétegkromatográfiával követjük az elúciót, futtatóelegyként benzol és metanol 7:3 arányú elegyét használjuk. Candida albicans-szal végzett bioautográfia segítségével mutatjuk ki az A-22082 jelű antibiotikumból és más, kisebb mennyiségben jelenlevő antibiotikum összetevőkből álló antibiotikum-komplex jelenlétét. Az antibiotikum-komplex a 136—190. frakcióban található. Egyesítjük ezeket a frakciókat, és csökkentett nyomáson ledesztilláljuk róluk az oldószereket, ily módon 453 mg antibiotikumot nyerünk. 3. példa Az A—22082 jelű antibiotikum elkülönítése Szilikagél oszlopot (1,5 x 6,0 cm, Woelm szilikagél) kromatografáljuk a 2. példában leírt módon nyert antibiotikum-komplex egy 200 mg-nyi részletét. 1 ml/perc sebességgel acetonitril és víz 95 :5 arányú elegyével eluáljuk az oszlopot, 5 ml-es frakciókat szedünk. A 2. példában leírttal azonos módon követjük az elúciót. Egyesítjük az A—22082 jelű antibiotikumot tartalmazó 1-3. frakciót, csökkentett nyomáson ledesztijláljhk az oldószereket, és ily módon egy olajos anyaghoz jutunk. Szilikagél oszlopon (1,5x12 cm, Woelm szilikagél) újra kromatografáljuk ezt az olajat, eluensként acetonitril és víz 97 :3 arányú elegyét használjuk. Az A—22082 jelű antibiotikumot tartalmazó 15-20. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
