174127. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alkálifém- vagy ammónium-inzulin tisztítására gélszűréssel
3 174127 4 Lautenschlager és munkatársai a 2 449076 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban, mely szerint az inzulint nátriumklorid hozzáadásával kisózzák egy semlegesített extraktumból, a kisózott terméket szűrik, a szűrőn levő maradékot újra oldják és az inzulint újból kisózzák, de a második kisózásnál alacsonyabb só koncentrációt alkalmaznak, mint az első kisózó lépésben. Egy harmadik iparilag fontos módszer az inzulin tisztítására abból áll, hogy az inzulint oldatából cink-inzulin komplexként csapják ki vagy kristályosítják. Általában a cink-inzulint egy cink ionokat tartalmazó pufferolt vizes oldatból csapják ki. Különböző pufferokat alkalmaznak, Petersen például a 2 626 228 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás szerinti eljárásban citromsav-citrát puffert használ. Jelenleg az inzulin tisztítására alkalmazott ipari eljárások általában mind a három fent említett eljárást magukban foglalják. Mivel a cink-inzulin az inzulin legfontosabb ipari alakja, az inzulin tisztítására szolgáló eljárás utolsó lépése általában egy cink kristályosítási lépés. Azonban az elmúlt években azt tapasztalták, hogy nem-inzulin fehérjék, melyek közül a proinzulin és proinzulin típusú fehérje a leggyakoribb, fordulnak elő minor komponensként az ipari cink-inzulinokban. Bár ezek a komponensek menynyisége általában kevesebb, mint az ipari cink-inzulinok 8 súlyszázaléka, azt tartják, hogy ezen komponensek közül néhány antigén vagy ímmunogén természetű. így például Chance és munkatársai: Sciense 161, 165 (1968), Steiner és munkatársai: Diabetes 18, 725 (1968) Bromer: Biosciense 20, 701 (1970), Rubinstein és munkatársai: Anna. Rév. Med. 22, 1 (1971). így a nem-inzulin fehérjéknek az inzulintól történő ipari méretű eltávolítása folyamatosan problémát jelent. „Inzulin” kifejezésen a jelen tárgyalásban nemcsak magát az inzulint értjük, hanem az inzulin-típusú fehérjéket is, mint amilyen a dezamino-inzulin. Mivel az inzulin és az inzulin-típusú fehérjék hasonló hipoglikémiás aktivitással rendelkeznek, rendszerint nem kívánatos az inzulin elkülönítése a többi pankreász fehérjétől, azaz általában nem szükséges homogén inzulin előállítása. Biológiai anyagok analitikai módon történő meghatározására szolgáló módszerek, mint például az elektroforézis és az ioncserélő kromatográfia, ismertek a nem-inzulin komponensek inzulin komponenstől való elkülönítésére az ipari (vagy még nyers) inzulin készítményekben. Ezekkel a módszerekkel az inzulinban magában és a dezaminált inzulinokban is meg lehet határozni az inzulin komponenst. Azonban ezen eljárások nagy méretben történő hasznosítása kérdéses. Jobban alkalmazható eljárás a nagy méretben történő használatra a gél-szűrés (ez a kifejezés szinonim a gél kizárásos kromatográfiával és a gél áteresztéses kromatográfiájával). E mószer szerint a fehérjéket egy olyan gélt tartalmazó oszlopon különítjük el, amely gél térhálósított oly módon, hogy minden egyes gél részecskén belül pórusok képződnek. Ezen pórusoknak meghatározott, mérhető a térfogatuk, mely egyenesen arányos a gél duzzadási fokával és fordítva arányos a térhálósítás mértékével. Mivel a kisebb molekulák jobban át tudnak hatolni ezeken a pórusokon, mint a nagyobb molekulák, a kisebb molekuláknak az oszlopon történő áthaladása akadályozott, míg a nagyobb molekulák csak részben vagy egyáltalán nem hatolnak át a pórusokon. Az inzulin tisztítására a múltban alkalmaztak már gél-szűrést. Az inzulinnak macska pankreászból történő elkülönítési eljárásában nyers inzulint állítottak elő oly módon, hogy azt sav-alkohol extrakciónak vetették alá, ezt követően alkalikus kicsapást végeztek a hatástalan anyag eltávolítására, a folyadékot betöményítették, izoelektromos kicsapást és végül egy nátriumkloridos kisózó kicsapást hajtottak végre. A nyers inzulint térhálós dextrán gélre vitték fel és 0,1 mólos ecetsavval eluálták [(Davoren: Biochim. Biophys. Acta 63, 150 (1962)]. A halból származó inzulin elkülönítését úgy végezték, hogy mirigyeket vízzel homogenizáltak és a fehérjéket triklórecetsav-oldattal csapták ki. A csapadékot sav-etanol eleggyel extraháták és az extraktumokat a zsírok eltávolítására metilénkloriddal kezelték. A visszamaradó szilárd anyagokat elkülönítették és 0,5 mólos ecetsavban oldották és az oldatot térhálós dextrán gél oszlopon szűrték át, majd 5,0 mólos ecetsavval eluálták. [Humbel: Biochem. Biophys. Res. Commun. 12, 333 (1963)]. A cikkben körülbelül 80%-os kitermelést adtak meg az eljárásra. Figyelembe kell vennünk Humbel azon állítását, hogy az inzulinnak az egyéb fehérjéktől való jó elkülönítése céljából az eluálási feltételeknél előnyben részesített az inzulin molekulák disszociációja. Azt állapítja meg továbbá, hogy az 1,0 mólos ecetsav nem kielégítő oldószer, mivel Yphantis és Waugh szerint [Biochim. Biophys. Acta 26, 218 (1957)] ebben az inzulin nem disszociál teljesen. Epstein és munkatársai a Biochemistry 2, 461 (1963)-ban leírtak szerint marha pankreász nyers extraktumát szűrték át térhálós dextrán gélen. Az eluálószer 0,2 mólos ammóniumhidrogénkarbonát volt, ezt az oldószert Humbel a fenti cikkben szintén elvetette, Epstein és munkatársai körülbelül 60%-os kitermelésről számolnak be. Emberi pankreászból is különítettek el inzulint. A mirigyeket először homogenizálták és extrahálták. Ammóniumszulfátos frakcionálással néhány hatástalan anyagot távolítottak el. Az inzulint először nátriumkloriddal, majd izoelektromosan kicsapják. A kapott inzulint 0,5 mólos ecetsavban oldják és az oldatot térhálós dextrán gélen szűrik. A leszűrt inzulint cink-inzulinná alakítják [Jackson és munkatársai: Diabetes 18, 206 (1969)]. A gél-szűrés után körülbelül 60%-os kitermeléssel kapták meg az inzulint. Végül gél-szűrést és ioncserélő kromatográfiát kombináltak Schlichtkrull és munkatársai, melyet a 69/5280 számú délafrikai szabadalmi bejelentésben Qásd 737 257 számú ekvivalens begjumi szabadalmi leírás) írtak le. Az egyetlen gél-szűrési példában 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
