173920. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hemagglutinin és neuraminidáz keverék szelektív elkülönítésére influenzavírusból
5 173920 6 A fenti általános képletekben X előnyösen klorid-, bromid-, szulfát vagy acetátaniont, elsősorban klorid- vagy bromidaniont jelent. Az előnyös Iaa általános képletű vegyületek elsősorban a mirisztiltrimetilammónium- és cetiltrimetilammóniumsókat, különösen kloridjaikat vagy bromidjaikat, mindenekelőtt bromidjaikat ölelik fel. Az előnyös láb általános képletű vegyületek sztearildimetilbenzilammóniumsókat, elsősorban kloridját vagy bromidját, mindenekelőtt bromidját ölelik fel. Az előnyös Ib általános képletű vegyületek cetilpiridiniumsók, elsősorban klorid vagy bromid, mindenekelőtt bromid. Egyéb célszerűen felhasználható kationos detergensek a benzalkóniumkloridok és -bromidok, például benzetóniumklorid vagy metilbenzetóniumklorid vagy olyanok, mint a dekametóniumklorid. A találmány szerinti eljárásban előnyösen használható kationos detergens a cetiltrimetilammóniumbromid. A fenti eljárás befejezése után a hemagglutinin- és neuraminidáz-komponensek keverékét a visszamaradó ép szubvirális részecskéktől ismert módon elválaszthatjuk. Ez az elválasztás a szétválasztandó részecskék eltérő méretén és sűrűségén alapul, és például gradiens-centrifugálással nádcukor- vagy nátriumglutamát-közeg felhasználásával, a gradiensek molekulaszita-kromatografálásával vagy ultracentrifugával végzett pelletálásával való frakcionálással végezhetjük. A találmány szerint előállított immunogén keveréket célszerűen influenza-vakcinákban alkalmazhatjuk. Ebből a célból a fent leírtak szerint elkülönített hemagglutinin- és neuraminidáz-komponens keverékét célszerűen egy szokásos oldószerben, például fiziológiás izotóniás oldatban, például 0,9%-os nátriumklorid-oldatban, amelyet adott esetben például foszfátpufferral pufferolunk, reszuszpendálunk. A kiindulási vírus tisztításából vagy a szolubilizált komponensek elválasztásából visszamaradó nádcukor részarányát célszerűen a vakcinára számított 5 s% alá kell csökkenteni, például dialízissel. A visszamaradó kationos detergens részarányát szintén nagymértékben csökkenteni kell, például a vakcinára számított 0,01 súly% alá, például dialízissel vagy gélkromatografálással. Ha kívánatos, a vakcinához konzerválószereket vagy inaktiváló-szereket, például formaldehidet adhatunk a szokásos mennyiségben, például 1 súlyrészt 10 000 súly részre számítva. A találmány szerint előállított vakcina immunogén hatását célszerűen a szokásos immunológiai adalékok, amilyen az alumíniumhidroxid vagy alumíniumfoszfát szokásos mennyiségben való hozzáadásával javíthatjuk. Előnyös 0,2% alumíniumhidroxid hozzáadása. Egy vizsgálatsorozatban egereken megvizsgáltuk a védettséget influenza-részegység-vakcinával és influenza teljes vírussal való immunizálás után különböző időben virulens influenza-vírussal történő terhelés mellett. Ez a modell magában foglalja az összes specifikus és nem specifikus védelmi mechanizmust. 30—30 egérből álló csoportoknak intraperitoneálisan 0,25 ml/egér antigént adtunk, 3, 4 és 8 hét múlva a csoportok egy részét permettel megfertőztük, és a fertőzés után 9 nappal a védelmet kiértékeltük. Értékelési alapnak a mortalitás csökkenését százalékban, és a tüdőbántalmak csökkenését százalékban választottuk. A vizsgálatot különböző antigéntartalmú vakcinákkal megismételtük. Az eredményekből kitűnt, hogy a találmány szerinti előállított részegység-vakcina a vírusfertőzéssel szemben hosszabb immunitást biztosít, másrészt az egész vírus-vakcinához képest párhuzamos hatást is mutat. A felhasználható adag nagysága különböző lehet. Általában kielégítő eredményeket érhetünk el, ha a vakcinát 9—43 nemzetközi egység/kg testsúly egyszeri adagban adjuk be. Nagyobb emlősök egyszeri adagja 600—3000 nemzetközi egység lehet. [Bull. Wld. Hlth. Org. 45, 473-86 (1971).] A beadás célszerűen szubkután vagy intramuszkulárisan történhet. A következő példák szemléltetik a találmány szerinti eljárást. 1. példa Az X—31 antigén típusú influenza-vírust (az A2/Aichi/68 törzs rekombinánsa) embriót tartalmazó tyúktojásban 2 napig 37 °C-on inkubálva szaporítjuk. Ezután a tojásokat 4 °C-ra lehűtjük, és éjszakán át állni hagyjuk. A kapott fertőzött allantois-folyadékokat egyesítjük. Ezután a virust az allantois-folyadékból átfolyós zónás centrifugával (RK-típus, Elektro-Nucleonics) foszfáttal pufferolt nátriumklorid-oldatban nádcukor-gradiens alkalmazásával centrifugálva koncentráljuk, és tisztítjuk. A nádcukor-tartalomnak foszfáttal pufferolt nátriumklorid-oldattal szemben való dialízise útján 5% alá való csökkentésével kapott víruskoncentrátum hemagglutinációs titere 1 :217 és proteintartalma 0,7 mg/rrü/ Az immunogének lehasítására a vírusszuszpenzióhoz térfogatának 1/50 részét kitevő vizes detergens-oldatot (cetiltrimetilammóniumbromid, 1%-os oldat) adunk. 30—60 perc múlva (szobahőmérsékleten) a reakciókeveréket gradiens centrifugálással feldolgozzuk egy előre kialakított lineáris nádcukor-grádiens felhasználásával, majd a grádiensek perisztaltikus szivattyúval történő frakcionálásával. A gradiens centrifugáláshoz az 1 gradiens-keverőbe azonos térfogatú könnyű, illetve nehéz gradienskomponenst töltöttünk. Ezután a gradienst a 2 perisztaltikus szivattyúval (lengőserleges rotor) mágneses keverés közben a keverőkamrából közvetlenül cellulóznitráttal töltött 3 kémcsövekbe juttattuk (2.A) ábra). A gradiens kialakítására általában nádcukor vagy nátriumglutaminát használható. A nátriumglutaminát előnye, hogy a neuraminidáz meghatározásához használt Aminoff-féle színreakciót nem zavarja, míg a nádcukor sárga színt ad. A vizsgált mintákat óvatosan a gradiensekre juttattuk (a minta fajlagos sűrűsége előnyösen a könnyebb gradienskomponens fajlagos sűrűsége alatt van). A centrifugálás után a szemmel felismerhető sávokat feljegyeztük úgy, hogy a gradienst felülről megvilágítottuk és sötét háttér előtt szemléltük. A gradiensek frakcionálása a 2 perisztaltikus szivattyúval történt (2.B ábra), és az extinkciós 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
