173676. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükopeptidek előállítására
7 173676 8 gyógyászatilag alkalmazható hordozó- és/vagy segédanyaggal elegyíthetjük. A készítmény jellege a kívánt adagolási módnak felel meg. Orális adagolásra előnyösen dózis egysége két, például kapszulákat, ostyatokos készítményeket vagy tablettákat állítunk elő, amelyek mindegyike előre meghatározott mennyiségű glükopeptidet tartalmaz. Orális adagolásra továbbá porkeverékeket, granulátumokat, vizes vagy nem-vizes szuszpenziókat, vagy olaj-a-vízben vagy víz-az-olajban típusú emulziókat is előállíthatunk. Pulmonáris adagolás céljára inhalációs készítményeket állítunk elő. Az injekció útján beadandó készítmények előállítása során a találmány szerint előállított és elkülönített glükopeptidet közömbös, gyógyászatilag alkalmazható folyékony hígítószerben szuszpendáljuk. Minden esetben steril, és a kezelendő emlős vagy szárnyas vérével azonos ozmózisnyomásű injekciós készítményt állítunk elő. Hígítószerként például vizet használhatunk. A humán gyógyászatban injekciós készítményként előnyösen a glükopeptid fiziológiás sóoldattal (0,83 vegyes%-os vizes nátriumklcrid-oldaítal) készített szuszpenzióját alkalmazzuk. Előnyösen a glükopeptidet aszeptikus körülmények között, steril hígítószerben szuszpendáljuk. Az injekciós készítményeket szokásos módon, például körülbelül 0,5 vegyes% formalin hozzáadásával sterilizálhatjuk. Az injekciós készítményekhez előnyösen konzerválószereket, például 0,01 vegyes% mennyiségű thiomersalátot adunk. A találmány szerint előállított injekciós készítmények ozmózisnyomását szokásos módszerekkel állíthatjuk be a kezelendő egyed vérével azonos értékre. Így például a készítményt a kezelendő emlős vagy szárnyas vérével azonos ozmózisnyomású sóoldatíal szemben dializálhatjuk. A dialízishez tetszés szerinti, injekciós közegként felhasználható sóoídatot, például fiziológiás sóoldatot (0,85 vegyes%-os vizes nátriumklarid-oldatot) vagy izeíóniás foszfátpuífer-oldatot alkalmazhatunk. Az injekciós készítményeket használatú kész formában, vagy felhasználás előtt hígítandó kon centrátumokként hozhatjuk forgalomba. A használatra kész injekciós készítmények előnyösen 2 -20 mg/ml, célszerűéi' körülbelül 7 mg/ml immunreakciót fokozó hatású glükopeptidet tartalmazhatnak. Az injekciós készítményeket általában például 5 vegyes%-os vizes szacharóz-oldat jelenlétében fagyasztva szárítjuk, és közvetlenül a felhasználás előtt vízzel a kívánt térfogatra hígítjuk. A találmány szerint előállított és elkülönített gliikopeptideket továbbá adjuvánsként alkalmazhatjuk, vagy több hatóanyagot tartalmazó vakcinák egyik hatóanyag-komponenseként használhatjuk fel. Így például a Fieund-féle teljes adjuvánsban (a hatóanyag ásványolajjal készített, víz-az-olajban típusú emulziója, amely hővel elölt baktériumokat is tartalmaz) a hővel elölt baktériumokat a találmány szerint előállított glükopeptidekkel helyettesíthetjük. A gliikopeptideket továbbá adjuvánsként adhatjuk például a Brucella elleni immunitás kifejlesztésére felhasznált vakcinákhoz. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 1. példa Immunreakciót fokozó hatású glükopeptid elkülönítése C. parvum sejtekből A) lépés C. parvum sejttenyészet előállítása 1 vegyes% glükózzal és 5 térfogat% lószérummal kiegészített 20 ml Robertson-féle húsleves-táptalajt csavaros kupakkal lezárható tartályba töltünk, és a táptalajt 0,2—0,5 mg fagyasztva szárított C. parvum-sejttel (a Wellcome cég törzsgyűjteményében CN-6134 számon letétbe helyezett törzs) oltjuk be. A rendszert 6 napon át 37°Con sztatikus körülmények között inkubáljuk, majd a kapott fermentlevet 1800 ml fenti táptalajt tartalmazó, 2 liter űrtartalmú tartályba töltjük, és az inkubálást a megadott körülmények között 6 napon át folytatjuk. Ezután a kapott fermentlevet 15 literes tartályba bemért táptalajra töltjük, és az inkubálást körülbelül 7 napon ái folytatjuk. Az oltóanyag térfogata minden esetben a táptalaj térfogatának körülbelül 10%-a, kivéve az utolsó tenyésztési lépést, amikor 2,5%-os inokulum-mennyiséget alkalmazunk. A tenyésztett sejtek elkülönítése céljából az utolsó lépésben kapott fermentlevet 2 órán át 2000 g gyorsuláson centrifugáljuk. A felső folyadékfázist elöntjük, a sejteket fiziológiás sóoldatban szuszpendáljuk, és a szuszpenziót a fenti körülmények között centrifugáljuk. Ezt a mosási műveletet többször megismételjük. B) lépés Sejtroncsolás 10 g nedves súlyú mosott sejtet 35 g 14-es méretű „Ballotini” üveggyönggyel és körülbelül 1 ml fiziológiás sóoldattal keverünk össze. A keveréket Novotny keverőberendezésben [Nature 202 (4930) 364—6, 1966. április 25.) 15 percig keverjük, a lapátkeverőt 2000 fordulat/perc sebességgel forgatjuk. A kapott szuszpenziót körülbelül 10 ml fiziológiás sóoldattal hígítjuk, és az üveggyöngyök eltávolítása érdekében durva zsugorított üveglemezen szűrjük. A maradékot körülbelül 10 ml fiziológiás sóoldatban ismét szuszpendáljuk, és a sejtfal-törmelékek elkülönítése céljából 1 órán át 20 000 g gyorsuláson centrifugáljuk. C) lépés A C. parvum sejtfalak extrahálása 20 g nedves súlyú C. parvum sejtfal-törmelékhez 350 ml 68°C-os desztillált vizet és 350 ml 68°C-os vizes fenolt (90 vegyes%) adunk. Az elegyet 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
