173662. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ovulációt serkentő új nonapeptidamid-származékok előállítására
21 173662 22 HONB-t és 46 mg DCC-t adunk. A reakcióelegyet ezt követően szobahőmérsékleten 12 órán át keverjük, majd a kivált diciklohexil-torbamidot kiszűrjük és a szűrletet csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot 120 ml etil-acetátban feloldjuk, majd az így kapott oldatot 4%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, ezután pedig vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A kapott maradékot kismennyiségű etanolban feloldjuk, majd az etanolos oldathoz étert adunk, amikor is a termék kicsapódik. A kicsapást megismételjük, amikor is 132 mg mennyiségben a por alakú cím szerinti vegyületet kapjuk. Fajlagos forgatóképesség [a]^6= -48,5° (c = 0,5, metanolban). Elemzési eredmények a C3oH4708N9 képlet alapján. számított: C =54,45%, N = 19,05%, H =7,16%, talált: C =54,48%, N =18,72%. H = 7,23%, Rf1= 0,79, Rf2= 0,92, Rf4=0,66. (c) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Nle-Arg-Pro-NH-CH2 -CH3 előállítása Hidrogén-bromid jégecettel készült 25%-os oldatából 5 ml-ben feloldunk 100 mg Z-(D)-Ala-Nle-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3-t, majd a topott oldatot szobahőmérsékleten 50 percen át keverjük. Ezután az oldathoz 40 ml vízmentes étert adunk, majd a képződött csapadékot kiszűrjük, éterrel mossuk és csökkentett nyomáson nátrium-hidroxid felett szárítjuk. A terméket ezután 40%-os vizes metanollal Amberlite CG-45 (szabad formájú) gyantából készült oszlopon átbocsátjuk a hidrogén-bromid eltávolítására. Az eluátumból a metanolt csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, majd a topott maradékot liofilizáljuk. Az így kapott liofilizátumot és 100 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH-t feloldunk 4 ml dimetü-formamidban, 45 mg HONB beadagolása után a reakcióelegyet —5 °C és -7 °C közötti hőmérsékletre lehűtjük, majd 40 mg DCC-t adunk hozzá. Ezt követően a reakcióelegyet jeges hűtés közben 5 órán át, majd szobahőmérsékleten 10 órán át keverjük. A dimetil-formamidot ezután elpárologtatjuk, majd a maradékhoz 30 ml etil-acetátot adunk. A topott elegyet szűrjük, majd a szűrőlepényt szárítjuk. A terméket ezután 2 ml, 0,05 ml anizolt és 0,05 ml mertoptoetanolt tartalmazó hidrogén-fluoridban feloldjuk, majd a kapott oldatot 0 °C-on 40 percen át keverjük. Ezt követően a hidrogén-fluoridot csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, majd a topott maradékot 10 ml vízben feloldjuk. Az oldhatatlan'részt ezután kiszűrjük, majd a szűrletet 1 cm átmérőjű és 5 cm hosszú, Amberlite IRA-410 (acetát formájú) gyantából készült oszlopon átbocsátjuk, amikor is a terméket a megfelelő acetáttá konvertáljuk. Az eluátumot ezután felvisszük egy 1,5 cm átmérőjű és 30 cm hosszú, karboximetil-cellulózból készült oszlopra, majd az oszlopot gradiens-módszerrel 400 ml 0,2 mólos ammónium-acetát-oldattal. 290 ml és 320 ml közötti frakciókat — amelyek ultraibolya abszorpciós spektruma a maximális abszorpciót mutatja — összeöntjük, majd liofilizáljuk, amikor is 105 mg mennyiségben a cím szerinti vegyületet topjuk teljes csapadék formájában. Fajlagos forgatóképesség [a]^=—46,0° (c-0,3, 5%-os vizes ecetsavban). Rf1= 0,063, Rf2= 0,360. Aminosav-elemzés (hidrolízis 5,7 normál sósavoldattal tioglikolsav jelenlétében): Glu=l,10, His=l,02, Trp = 0,91, Ser = 0,98, Tyr=l,00, Alá =1,00, Nie =1,02, Arg = 0,98, Pro = 0,97, etil-amin = 1,04 (84%-os átlagos visszanyerés). 7. példa (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-(D)-Ala-Ile-Arg-Pro-NH-CH2-CH3 előállítása Automatikus peptidszintetizáló berendezés (APS-800 típusú, gyártócége Shimudzu Seisakusho, Ltd. japán cég) reaktorába bemérünk 3 g BOC-Pro-gyantát (prolintartalma: 0314 millimól/g), majd a gyantát 12 órán át diklór-metánnal düzzasztjuk. Ezek után a berendezésbe az alábbiakban részletezett módon különböző aminosavatot juttatunk: Diklór-metán (háromszor 3 perc) -* 50%-os trifluor-ecetsav/diklór-metán (10 perc és 30 perc, kétszer) -* diklór-metán (háromszor 3 perc) -* etanol (háromszor 3 perc) -* diklór-metán (háromszor 3 perc)-* 10%-os trietü-amin/kloroform (10 perc)-* kloroform (háromszor 3 perc) -* diklór-metán (háromszor 3 perc) -* BOC-aminosavanhidrid (előállítható ismert módon BOC-aminosavból és DCC-ből) (30 perc és 60 perc, kétszer) -* acetilezés (diklór-metán, trietil-amin és ecetsavanhidrid 1 órán át)-* diklór-metán (háromszor 3 perc). A fenti műveleti lépések során csak a (Pyr)Glu-OH-t használjuk BOC-védőcsoport nélkül és a kondenzációs reakciót dimetil-formamidban foganatosítjuk DCC-vel. Természetesen a fenti lépéssorozatot annyiszor ismételjük meg, ahány aminosavat kapcsolunk egymáshoz. Végül a gyantát egymást követően etanollal, kloroformmal, dimetil-formamiddal és éterrel mossuk, majd megszárítjuk. így 4,12 g gyantát topunk. A fenti műveletek során az alábbi BOC-aminosavatot használjuk: BOC-Arg(Tos-OH), BOC-Ile-OH, BOC<D)-Ala-OH, BOC-Phe-OH, BOC-Ser(Bzl)-OH, BOC-Trp-OH, BOC-His(Tos)-OH. A fenti gyantából 3 g-ot 20 ml dimetil-formamidban szuszpendálunk, majd a szuszpenziót 20 °C-on etil-aminnal telítjük. A reakcióelegyet ezután szobahőmérsékleten 40 órán át keverjük, majd a gyantát kiszűrjük és a szűrletet csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A topott maradékot éterrel eldörzsöljük, amikor is 720 mg por alakjában a nyers (Pyr)Glu-His-(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Phe-(D)-Ala-De-Arg(Tos)-Pro-NH-CH2 -CH3 -t topjuk. Ezt a port ezután feloldjuk etil-acetát, piridin, ecetsav és víz 60 : 20 : 6 :10 arányú elegyében, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11 > &
