173548. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns influenza-vírustörzs és e törzset tartalmazó vakcina előállítására
7 173548 8 ben vizsgáljuk, majd az eredmények alapján kiválasztjuk azokat a rekombinánsokat, amelyek antigén-összetétele azonos a virulens A-típusú influenza alaptörzsével, és így vakcinakészítésre alkalmasak. A következő lépésben az így kiválasztott tenyészeteket az alapvírusok maradékainak elkülönítése és a további vizsgálatok alapján meg nem felelőnek bizonyult rekombinánsok eltávolítása céljából a korábban részletezett módon klónozzuk. A klónozást az idézett Postgraduate Medical Journal szakcikkben ismertetett határhígításos módszerrel végezzük. Ezután a vírushozam növelése céljából minden kiválasztott rekombináns törzset megfelelő tojástenyészeten, például SPF tojásokon vagy azokból származó AOS tenyészeteken 1—2 lépésben tovább tenyésztünk, és az SPF tojásokon kapott, steril, antibiotikum-mentes oltóanyagokat önként jelentkező egyéneken kipróbáljuk. E kísérletek során a rekombináns törzs genetikai stabilitását és emberen kifejtett immunhatását tanulmányozzuk. A találmány tárgya tehát továbbá eljárás a fentieknek megfelelő rekombináns influenza-vírustörzsek előállítására, amelynek során a túlgyengített influenza alaptörzs eredeti fertőzőképességének körülbelül 99%-át inaktiváljuk, ezt a törzset a virulens alaptörzzsel együtt egy közös tenyészetbe oltjuk be, a tenyészetet inkubáljuk, majd a vírustörzset az alaptörzsek elválasztása és a rekombináns törzsek elkülönítése céljából klónozzuk. Az eljárás során hemagglutinációs és neuraminidáz-gátló kísérletekkel meghatározzuk a kívánt antigén karaktert és az elkülönített rekombinánst klónozzuk. A legyengített alaptörzs szaporodásának visszaszorítására általában egy alkalmas hiperimmun szérumot adunk a tenyészethez. Ezután az így kapott tenyészeteket szokásos hemagglutinációs és antigenicitási vizsgálatnak vetjük alá, e vizsgálatok alapján kiválasztjuk a megfelelő rekombinánsokat, és a kívánt rekombinánst klónozással izoláljuk. Egy további kísérletben a kiválasztott rekombináns törzs steril mintáját újból elkülönítjük az önként jelentkező kísérleti egyének szervezetéből, például úgy, hogy a rekombináns törzset intranazálisan beadjuk, majd a kezelt egyénektől orrkenetet veszünk. Az így kapott vírus-oltóanyagot ezután tojás-tenyészetekben előnyösen kétszer tovább tenyészthetjük, majd ezekből hígítószer, például foszfáttal puff er olt nátriumklorid-oldat és stabilizálószerek, előnyösen hidrolizált zselatin és szerbit felhasználásával vakcinákat készítünk. A kapott vakcinákat kívánt esetben fagyasztva szárítjuk, és csak közvetlenül a felhasználás előtt hígítjuk folyékony közeggel. Ezeket a vakcinákat embereknek előnyösen intranazálisan adjuk be. A találmány tárgya tehát továbbá eljárás a fentiek szerinti rekombináns influenza-vírustörzseket tartalmazó vakcinák előállítására. Ezen túlmenően a találmány oltalmi köre a fentiek szerinti rekombináns influenza-vírustörzseket tartalmazó vakcinákra is kiterjed. A találmányt az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. A/OKUDA/57(H2N2) - A/ENGLAND/42/72 (H3N2) rekombináns törzs előállítása (i) Az alaptörzsek előállítása (a) a legyengített vírustörzs [A/OKUDA/57 (HjN2)] előállítása A kizárólag tojás-tenyészetekben sorozatban tenyésztett Okuda A-2 törzs, amit Japánban aeroszol formájában gyermekek tízezreinek adtak be anélkül, hogy bármiféle kellemetlen mellékhatást észleltek volna, a 280. sorozattenyésztési lépés után kapott, 1 :1280-as hemagglutinációs faktorral rendelkező, liofilizált minta formájában áll rendelkezésünkre. Ehhez a liofilizátumhoz 1,5 ml, 10% triptóz-táptalajt tartalmazó, foszfáttal pufferolt vizes nátriumklorid-oldatot, 1500 nemzetközi egység penicillint és 1500 nemzetközi egység sztreptomicint adunk, majd a rendszert 3 db 10 napos SPF tojás allantoisz-üregébe fecskendezzük, és 3 napon át 35 C°-on inkubáljuk. Egy tojás allantoisz-folyadékát elkülönítjük és kis térfogatú részletekre elosztva -60 °Con tároljuk. A rekombinációs kísérlet során egy kis alikvot részletet felengedünk, 1 :100 arányban normál nátriumklorid-oldattal hígítjuk, majd 30 percig ultraibolya fénnyel besugározzuk higanygőzlámpával, amelynek maximális emissziója 2540 Â, mintegy 2 x 104 erg/cn^-el [B. Túr no va, H. G. Pereira, Genetic interaction between influenza A viruses of human and animal origin, Virology 27, 253-261 (1965)]. Ez a kezelés elegendő ahhoz, hogy a vírus teljes fertőzőképességét körülbelül 99%-kal csökkentse. (b) A virulens vírustörzs [A/ENGLAND/42/72 H3N2)] előállítása Ez a törzs a National Institute of Medical Research intézetben (Mill Hill, Nagy-Britannia) liofilizált allantoisz-folyadékminta formájában áll rendelkezésre. A vírustörzset tojáson végzett három sorozattenyésztési lépés után tojásból izolálták. A vírus hemagglutinin-faktora 1:128. A liofilizált anyagot foszfáttal pufferolt sóoldat, 10% triptóz-foszfát-táptalaj, 1000 nemzetközi egység penicillin és 1000 nemzetközi egység sztreptomicin elegy ével keverjük össze. 02 ml így kapott anyagot 3 db 10 napos SPF-tojás allantoisz-üregébe fecskendezünk, és a rendszert 3 napig 35 °C-on inkubáljuk. Egy tojás allantoisz-folyadékát elkülönítjük, és kis térfogatú részletekre elosztva -60 °C-on tároljuk. (ii) Rekombináció és a rekombinánsok elkülönítése 10 napos SPF tojásokból AOS-tenyészeteket készítünk, és a tenyészeteket hemagglutinációs mintatartály üregeibe helyezzük. Minen egyes tenyészethez mindkét vírusból 0,03—0ß3 ml térfogatú mintát adunk, az A Okuda törzset besugárzás előtt normál nátriumklorid-oldatban 1 :100 arányban, míg az élő A England törzset ugyanazzal a hígítószerrel 1 :30 arányban hígítottuk. A mintatartályt 1. példa 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
