173548. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns influenza-vírustörzs és e törzset tartalmazó vakcina előállítására
3 173548 4 gyártást a járvány kitörésének első jelére már azonnal megkezdik. Tekintettel arra, hogy a jövőbeni járványkeltő influenza-vírustörzsek antigén-szerkezetében előre nem látható változások következnek be, nem érdemes a vakcinákat nagy tételben előre gyártani és tárolni, hanem a lehető legrövidebb időn belül az éppen elterjedő új járványkeltő törzshöz adaptált új oltóanyagot kell előállítani. A fentiekre tekintettel korábban már javasolták az élő, legyengített influenza vírus-vakcinák alkalmazását. E vakcinák előállítása során a vírustörzset különféle sejtrendszereken sorozattenyésztésnek alávetve mindaddig gyengítik, amíg a vírus kórokozó sajátságait teljes mértékben el nem veszíti, anélkül azonban, hogy a vírus immunogén sajátságai változást szenvednek. Ilyenkor nevezzük gyengítettnek. Minthogy e legyengített élő vírusok a gazdaszervezetben bizonyos mértékben elszaporodnak, a kezeléshez csak kis mennyiségű oltóanyagra van szükség, ami jelentősen csökkenti az oltóanyag előállításának idő és munkaigényét. E vakcinák alkalmazhatóságának azonban lényeges előfeltétele, hogy a legyengített törzsek ártalmatlanok legyenek, és érintkezés útján csak minimális mértékben fertőzzenek. Ismeretes [v.ö. pl. J. Infect. Dis. (1971) 124. (5) 449 és 463], hogy különböző influenza-vírustörzsekből genetikus rekombinációs törzsek alakíthatók ki, amelyek mindkét alaptörzshöz viszonyítva a kívánt kedvező sajátságokkal rendelkeznek. Ezek a rekombinációs törzsek fokozott antigén hatással rendelkeznek, és mind inaktivált, mind pedig élő vakcinák előállításához előnyösen alkalmazhatók. Már ismertettek és vizsgáltak legyengített törzsből és virulens törzsből kialakított hibrid törzseket, azonban a gyakorlatban az így előállított rekombinációs variánsok egyike sem vált be. Javasolták továbbá a különféle sejtrendszereken (beleértve az emlősök sejtrendszereit is) végrehajtott sorozattenyésztéssel legyengített influenza-vírustörzsek alkalmazását is. A gyakorlatban azonban az így kapott törzsek gyógyászati biztonsági okokból - a legyengített alaptörzs előéletére figyelemmel - nem voltak alkalmazhatók. Azt találtuk, hogy a gyógyászatban előnyösen alkalmazható rekombináns vírustörzset állíthatunk elő a túlgyengített A-típusú influenza-alaptörzsből, azaz gyenge fertőzőhatásig sorozatban továbbtenyésztett és vakcina előállítására alkalmatlan törzsből és egy virulens A-típusú influenza alaptörzs rekombinációjával. E rekombináns törzsek a túlgyengített alaptörzs növekedési jellemzőivel és a virulens alaptörzs antigén sajátságaival rendelkeznek. Túlgyengített alaptörzsként kizárólag tyúktojás-tenyészetekben továbbtenyésztett, e tenyészetekben jó szaporodóképességű, azaz ElDso/ml>108 értékű, és ugyanakkor borjú-vesesejtekben a virulens A-típusú influenza-vírustörzsnél több foltot képező túlgyengített törzseket alkalmazunk, előnyösen. Az EID50/ml kifejezésen azt, a tojásban keletkező fertőző dózist értjük, amely a fertőzött tojások 50%-ban keletkezik, és amelyet a Virology Mongraphs 4, „The Influenza Viruses, L. Hoyle, 77 cikkben leírt módszerhez hasonlóan határozunk meg. Virulens A-típusú influenza-alaptörzsként pedig olyan törzset használunk fel, amely tenyésztés során a túlgyengített alaptörzsnél kisebb mennyiségű vírust termel, és egyéb, szennyező emlős-vírusoktól mentes (a National Institute of Biological Standards and Control, London módszerei szerint meghatározva). Az első törzzsel kapcsolatban alkalmazott „túlgyengített” megjelölés azt jelenti, hogy a legyengítéshez használt sorozattenyésztési lépések száma lényegesen nagyobb a patogén jelleg megszüntetéséhez szükséges lépések számánál. Az így túlgyengített vírus azonban még e nagyszámú tenyésztési lépés után is megtartja antigén jellegét, azaz mind hemagglutinin (H), mind pedig neuraminidáz (N) antigénjét, így immunizáló képessége nem romlik, (A hemagglutinin antigén egy olyan antigén, amely a vírus tetején található és vörös vérsejteket agglutinál.) Az ilyen törzsek érzékeny egyéneknek, például gyermekeknek beadva gyakorlatilag semmiféle tünetet vagy mellékhatást nem váltanak ki, és megfelelő vizsgálati módszerek alapján várhatóan kielégítő biztonsággal alkalmazhatók. Annak érdekében, hogy a legyengített vírustörzs és az éppen uralkodó járványkeltő virulens törzs antigén-szerkezete között kellő különbséget biztosítsunk, és ugyanakkor a biztonságos alkalmazás feltételeinek is eleget tegyünk, legyengített vírustörzsként célszerűen például olyan A-2 törzseket alkalmazhatunk, amelyeket 10, sőt 20 évvel ezelőtt különítettek el. A rekombináns törzs kialakításához felhasznált két alaptörzs hemmaglutinin antitest-típusának legalább egy egysegei el kell térnie egymástól, így például H2 és H3 hemmaglutinin antitest-típusú törzseket alkalmazhatunk, ahol a nagyobb szám az újabban izolált virulens törzs antitest-típusának felel meg. A hemagglutinin (H) és a neuraminidáz (N) antigén minden egyes alap-altípusát egy számmal azonosítjuk. Minél nagyobb ez a szám, annál később izolálták a vírust, amely ezt az antigén- variánst tartalmazza. A legyengített törzseket például a 310 662 számú japán szabadalmi leírásban ismertetett módon, tojásokban végzett sorozattenyésztéssel alakíthatjuk ki. Az idézett japán szabadalmi leírás az 1957. évi járvány alkalmával Osakában (Japán) elkülönített A-2 típusú influenza vírustörzsből a leírás szerinti legyengítési módszerrel kialakított A(OKUDA)57 (H2N2) törzs előállítását ismerteti. Legyengített törzsként másodikként az American Type Culture Collection (ATCC) gyűjteményben VR-100 számon letétbe helyezett, A2(JAPÁN)305/57 jelű törzset alkalmazhatjuk/ A találmány szerint alkalmazható legyengített vírustörzsek közül a legkedvezőbbnek ítélt A(OKUDA)57 (H2N2). törzs a National Institute for Biological Standards and Control, Holly Hill, Hampstead, London NW3 intézetben beszerezhető. Az intézetben e törzset a tojásokon végzett 280. tenyésztési lépés után helyezték letétbe. A találmány szerinti rekombinációs törzsek kialakításához szükséges másik törzs számos A-típusú influenza-vírustörzs lehet, feltéve, hogy a törzs 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
