173366. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szteroidok mikrobiológiai oxidálására
7 173366 8 lyen az ammóniumszulfát és ammóniumklorid, foszfort és káliumot tartalmazó vegyületeket, amilyen a dikáliumhidrogénfoszfát, és fémek, például vas, réz, magnézium, kobalt, cink és kalcium sóit. A táptalajok egyéb alkotórészeket, például vitaminokat is tartalmazhatnak, ha a fő alkotórészek hatását nem zavaiják. A táptalaj összetétele a használt mikroorganizmus fajtájától függ. Szénforrás, nitrogénforrás, kálium, foszfor és magnézium a táptalaj lényeges összetevői. Szükség esetén a táptalajhoz habzásgátló, például polioxialkilénglikol is adható. Ez az adalék azonban nem feltétlenül szükséges, mivel a glicerideket tartalmazó anyagoknak habzást gátló hatásuk is van. A táptalaj felületaktív vegyületet is tartalmazhat, de ez nem feltétlenül szükséges, azonban hatására a táptalaj könnyebben kezelhető. A felületaktív adalékok közül például megemlíthetjük a polioxietilén-szorbitánmonosztearátot, szorbitánmonopalmitátot és polietilénglikol-monosztearátot. A DHT és ADD nagy kitermelésének biztosításához szükséges a táptalajhoz oxidációs inhibitort is hozzáadni. Inhibitorként például nikkel- és kobaltsókat, továbbá vas- és rézionokkal kelátokat alkotó kelátozószerkezetet használhatunk. Kelátozószer például az 1,10-fenantrolin, 2,2’-dipiridil, 8-hidroxikinolin, N-nitrozofenilhidroxilamin (kupferron), izonikotinsavhidrazid, o-feniléndiamin és nátrium-N,N’-dietilditiokarbamát. Különösen előnyös az 1,10-fenantrolin, 2,2’-dipiridil és 8-hidroxikinolin. A táptalajban a kelátozószer koncentrációja a szer jellegétől és a táptalaj összetételétől függ. Általában ez a koncentráció körülbelül 1x10—s és 1x10—2 mól között lehet. Az időpont, amikor a kelátozószert a táptalajhoz adjuk, a mikrorganizmustól és a táptalaj összetételétől függ. Általában a kelátozószert a fermentáció kezdetétől számított körülbelül 10-60 óra múlva adjuk a táptalajhoz. A fermentáció hőmérséklete általában körülbelül 20 és 37 °C között van. Az Arthrobacter vagy Brevibacterium nembe tartozó mikroorganizmus alkalmazása esetén az előnyös fermentációs hőmérséklet körülbelül 30 °C és a Mycobacterium nembe tartozó mikroorganizmus használata esetén a hőmérséklet előnyösen 35 °C körül van. A táptalaj kezdeti pH-értéke 5 és 8 között van, előnyösen körülbelül 7. A kiindulási szteroidot ismert módon, például melegítéssel vagy forró gőzzel kezelve sterilizáljuk és például por vagy oldószerrel, így dimetilformamiddal készült oldat vagy ultrahangos kezeléssel előállított szuszpenzió alakjában juttatjuk a táptalajba. A kiindulási szteroidot és a felületaktív vegyületet előnyösen egyszerre tápláljuk be, mivel így a kiindulási szteroid jobb diszpergálása biztosítható. A kiindulási szteroidnak a táptalajhoz történő hozzáadás időpontja az alkalmazott mikroorganizmustól és a kiindulási szteroidtól függ. Általában a kiindulási szteroidot a fermentáció kezdetétől számított 30 órán belül adjuk a táptalajhoz. Ha a mikroorganizmus nem szaporodik kellő mértékben, akkor a kiindulási szteroid a fermentációtól számított 30 óránt túl is hozzáadható. A mikroorganizmus szaporodásától függően a kiindulási szteroid részletekben is a táptalajhoz adható. 4 A gliceridtartalmú anyagok és/vagy növényi olajat tartalmazó lisztek a felhasznált mikroorganizmusok fejlődését a mikrobiológiai oxidáció összes szakaszában fokozzák. Ezért ezeket általában már a fermentáció kezdetén a táptalajhoz adjuk. A gliceridtartalmú anyagok és növényi olajat tartalmazó lisztek feltételezhetően különösen hatásosak a szteroid 17-helyzetű oldalláncának oxidációja esetén. Ennek megfelelően a gliceridtartalmú anyagoknak és/vagy növényi olajat tartalmazó liszteknek a kiindulási szteroid hozzáadásával egyidejűleg vagy körülbelül a kiindulási szteroid hozzáadása után 50 órán belül történő hozzáadása a DHT és ADD kitermelését számottevően növeli. A gliceridtartalmú anyagokat előnyösen a fermentáció során részletekben adjuk hozzá, és a végkoncentrációt a korábban megadott értékekre állítjuk be, mivel habzást gátlóként is hatnak. A végkoncentráció kifejezés a táptalajhoz hozzáadott gliceridtartalmú anyagokban levő összes gliceridet jelenti, habár a gliceridek mennyisége a fermentáció során végbemenő asszimilációval csökken. A találmány szerinti eljárásban termékként DHT-t és ADD-t kapunk. A szterinek oxidációjára korábban megadott mechanizmus figyelembevételével az ADD feltételzhetően a DHT 17-helyzetű hidroxilcsoportjának oxidációjával keletkezik. Az 1. ábrából látható, hogy a DHT kezdetben magas koncentrációja a kiindulási szteroid oxidációja előrehaladtával csökken és az ADD koncentrációja egyidejűleg növekszik- Ebből következik, hogy a DHT magas koncentrációjának biztosítására a fermentációt az oxidáció korai szakaszában kell megszakítani, míg az ADD nagy koncentrációjának eléréséhez a fermentációt hosszabb ideig kell folytatni. A DHT vagy ADD nagy koncentrációt biztosító fermentációs ideje a felhasznált mikroorganizmustól, a fermentáció hőmérsékletétől és a táptalaj összetételétől függ. A DHT nagy koncentrációjának biztosítására a fermentációt a kelátozószer hozzáadása után előnyösen körülbelül 15—35 óra múlva megszakítjuk. Az ADD-t nagy koncentrációban úgy kaphatjuk, ha a fermentációt a kelátozószer hozzáadása után körülbelül 35-90 órán belül szakítjuk meg. A fermentáció befejeződése után a kapott DHT-t és ADD-t a fermentlétől ismert módon elválasztjuk. A termékek elválasztásának egyik különösen előnyös módszere szerint a fermentlevet vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, például metilénkloriddal, kloroformmal, dietiléterrel, benzollal, toluollal vagy etilacetáttal extraháljuk. A kapott kivonatot bepároljuk, és a maradékot oldószerből, például ciklohexánból átkristályosítva vagy oldószerelegyből, például xilolból és hexánból leválasztva tisztítjuk. A termékeket kovasavgélen vagy alumíniumoxidon is szétválaszthatjuk és kromatografálással tisztíthatjuk. Eluálószerként például petrolétert, benzolt, kloroformot, dietilétert vagy metanolt használhatunk. A szétválasztott termékeket oldószerből ismételten átkristályosítva tisztíthatjuk. A következő példák szemléltetik a találmány szerinti eljárást. A termékanalízist gázkromatografálással végeztük és a megadott százalékos értékek az integrált területekre vonatkoznak. A százalékos mennyiségek ellenkező közlése híján súly%-ra vonatkoznak. A hőmérsékleti adatokat Celsius-fokban adjuk meg-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
