173315. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cink-bacitracin előállítására
3 173315 4 izoleucint termelő mutánst állítottak elő. (J. Biochem. Microbiol. Technoi. Eng. 2, 361—379, 1960.) Találmányunk tárgya eljárás cink-bacitracin előállítására bacitracint termelő Bacillus törzs aerob fermentációjával, asszimilálható szenet és szerves nitrogént, valamint szervetlen nitrogénforrásként ammóniumiont tartalmazó táptalajon, a fermentáció után a biomassza elválasztását követően cink-bacitracin képzésével és a kapott szuszpenzió porlasztva szárításával, azzal jellemezve, hogy a bacitracint egy izoleucin-hidroxamáttal végzett kezelés után kapott Bacillus licheniformis vagy Bacillus subtilis törzs előnyösen 0,2-0,4% ammóniumszulfátot tartalmazó fermentációs táptalajon történő tenyésztésével állítjuk elő. A találmányunk szerinti eljárás foganatosítására mind Bacillus subtilis, mind Bacillus licheniformis törzseket alkalmazhatunk. így kiindulhatunk a Bacillus subtilis ATCC 14 593, Bacillus licheniformis ATCC 10 7Í6, ami azonos Bacillus licheniformis ATCC 11 944, Bacillus licheniformis ATCC 11 945 és Bacillus licheniformis ATCC 11 946 jelű törzsekből. Alkalmazhatunk azonban más, bacitracint termelő Bacillustörzset is. A fermentációhoz előnyösen olyan törzseket alkalmazunk, amelyeket 1,25-5,0 mg/ml izoleucin-hidroxámsawal kezelünk. E kezelés eredményeképpen kapott néhány B. licheniformis törzset példaképpen letétbe helyeztünk az Országos Közegészségügyi Intézet Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében, mégpedig a - HB-601 004, HB—603 011, HB-101 035 jelűt, 00 120, 00 119, 00 121 számok alatt 1973. december 11-én. Az alábbiakban részletesen ismertetjük a hidroxámsav kezelését, egy bacitracint termelő Bacillus lichenoformis törzsön. B—1 jelzésű szilárd táptalajról származó tenyészetből szuszpenziót készítünk és ezt 3. számú bouillonba oltjuk. A B—1 jelzésű szilárd táptalaj összetétele: húskivonat (szárazsúly) 3,0 g pepton 5,0 g glukóz 10,0 g MnCl2 0,005g agar 20,0 g desztillált víz 1000,0 ml A 3. számú bouillon összetétele: húskivonat (szárazsúly) 3,0 g élesztőkivonat (szárazsúly) 2,0 g trypkazin 3,0 g pepton 10,0 g MnCl2 0,005g glukóz 2,0 g desztillált víz 1000,0 ml A 3. számú bouillonból 100 ml-t töltünk 500 ml-es Erlenmeyer-lombikba. A szuszpenzióval való oltás után 60—70 órán át 28 °C-on rázóasztalon inkubáljuk a tenyészetet, csaknem teljes bespórázásig. A bespórázott tenyészetet sterilen centrifugáljuk, háromszor mossuk desztillált vízzel. Az utolsó centrifugálás után BM jelű minimál táplevesben szuszpendáljuk a bespórázott tenyészetet. 2 A BM jelű minimál tápleves összetétele: (NH4)2S04 2,2 g KH2P04-2H20 6,6 g K2HP04 15,4 g Na-citrát 1,L g MgS04 sicc. 0,1 lg desztillált víz 1000,0 ml Megfelelő hígítás után a szuszpenzió 0,1-0,1 ml-vel oltjuk az ugyancsak BM jelű minimál tápleveseket, melyek izoleucinhidroxámsavat tartalmaznak 5,0, 2,5 és 1,25 mg/ml koncentrációba. 24 órás, 37 °C-on történő inkubálás után az egyes tenyészetekből a fent leírt összetételű B—1 jelzésű agar lemezekre szélesztünk, melyeket azután 72 órán át 37 °C-on inkubálunk. A kifejlődött telepeket ugyancsak B—1 jelzésű szilárd táptalajra izoláljuk át. Ezeket újabb 72 órán át tenyésztjük 37 °C-on, majd 24 órán át 4 °C-on tartjuk és erről készítjük el a már leírt módon, a 3. számú bouillonal spóraszuszpenziót, melyet —15 °C-on fagyasztva tárolunk. Az így kapott és tárolt törzseket bacitracintermelésre üvegfermentorban vizsgáltuk meg, mely technológia részletes leírását az 1. számú példa mutatja be. Az izoleucin bioszintézis szempontjából derepresszált, eddig megvizsgált mutánsok bacitracin termelését az alábbi táblázat szemlélteti. Bacitracin 300- 350- 400-450- 480- 510-550-termelés -350-400-450-480-510-550-590 E/ml mutánsok száma db 4 10 44 78 54 36 10 Az ily módon, izoleucin-hidroxámsav kezelés után kapott mutánsok közül a legmagasabb bacitracint ter-, melő, s az ipari termelésre legalkalmasabb mutánst kiválasztva, további „természetes” szelekcióval nyertük a B. licheniformis HB—101 035 jelű az Országos Közegészségügyi Intézetnél MNG 00 121 szám alatt letétbe helyezett törzset. Ennek a törzsnek a bacitracintermelése tehát — a vizsgált körülmények mellett (lásd 1. és 2. példa) — 570-590 E/ml. Az új törzsekre jellemző, hogy nitrogén-anyagcseréjük - bacitracintermelési szempontból — előnyösebb a kiindulási törzseknél. Míg a kiindulási törzseknél 0,15—0,20% ammóniumszulfát-koncentráció felett — egyébként azonos táptalajösszetételt alkalmazva — a bacitracintermelés csökken, addig az izoleucinhidroxámsav-kezelés útján kapott törzsek fermentálásánál az ammóniumszulfát-koncentráció növelés 0,15—0,3% között növeli a bacitracintermelési, 0,3-0,5% között pedig nem csökkenti. így pl. koncentráltabb fermentációs táptalajon, 0,3% ammóniumszulfáttal a bacitracintermelés 700 E/ml fölé emelkedik (3. példa). A találmányunk szerint előnyös oly táptalajon fermentálunk, amely 6—9% szójalisztet, 2,25—3,4% burgonyakeményítőt, 0,2-0,4% ammóniumszulfátot s egyéb szervetlen sókat, habzásgátlókat tartalmaz. A fermentlét előnyösen úgy dolgozzuk fel, hogy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
