173040. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-D-(-)-alfa-amino-alfa-(p-hidroxi-fenilacetamido)-dezacetoxi-cef-3-ém 4-karbonsav és származékai előállítására
3 173040 4-em-4-karbonsavhoz annyi vizet adtunk, hogy a kapott elegy össztérfogata 1 liter legyen. Az elegyet keverés közben 37 °€-on inkubáltuk, és a reakció lefolyását kromatográfiás vizsgálattal követtük. A kromatográfiás vizsgálat során 5 mikroliter mintát cseppentettünk fel, körülbelül 1,3 cm szélességű Whatman No. 1. papírcsíkokra 1, 2, 3 és 4 óra elteltével. A papírcsíkokat megszárítottuk, és 80 rész butilacetátot, 15 rész n-butanolt, 40 rész ecetsavat és 24 rész vizet tartalmazó oldószereleggyel fejlesztettük ki a kromatogramokat, amelyeket Bacillus szubtilis-szel beoltott, 6 pH-értékű, 28 °C-on egy éjszakán át inkubált agar-agar lemezeken biológiai értékelésnek vetettünk alá. összehasonlító anyagként 7-D-(-)-a-amino-a‘ -(p-hidroxifenilaceta mido)-dezacetoxi-cef-3-em-4- -karbonsawal is elvégeztük a kromatográfiás vizsgálatot. A vizsgálati eredmények azt mutatták, hogy a reakció 4 óra alatt teljesen lejátszódott. 4 óra elteltével a reakcióelegy 440 mg 7-D-(-)-a-amino-a-(p-hidroxifenilacetamído )-dezacetoxi-cef-3-em-4-karbonsavat tartalmazott (elméleti termelés 450 mg). A reakcióelegyet centrifugáltuk, a felülúszó folyadék savasságát sósavval pH=4,0 értékre állítottuk be, és liofilizáltuk. összesen 2,3 g líofilizált anyagot erős keverés közben 75 ml vízben szuszpendáltunk, és 2 perc alatt 150 ml acetont adtunk hozzá. Az elegyet 20 percig kevertük, a csapadékot redős szűrőpapíron szűrtük, a szűrlethez 2—3 csepp telített vizes báriumklorid-oldatot adtunk erős keverés közben, és ilyen módon a fehérjéket kicsaptuk. A szuszpenziót ismét szűrtük redős szűrőn, és a szűrletet vákuumban 20 °C alatti hőmérsékleten, körülbelül 25 ml-es térfogatúra koncentráltuk. Az oldatot szűrtük, és a szűrletet csökkentett nyomáson és 22 °C alatti hőmérsékleten bepároltuk. A körülbelül 2 ml térfogatú maradékhoz 10 ml dimetilformamidot adtunk, majd kapargatással és keveréssel a kristályosodást megindítottuk. Az elegyet 20 percig kevertük, a terméket szűrtük, 2 ml dimetilformamiddal (háromszor) és 20 ml acetonnal (négyszer) mostuk. A levegőn megszáradt anyagot 2 órán át szárítottuk 1 Hgmm nyomás alatti vákuumban foszforpentoxidon. 500 mg terméket kaptunk, amely szolvátként dímetilformamidot tartalmazott. Infravörös spektruma megfelelt a 7-D-(-)-a-amino-a-(p-hidroxifenilace tamido)-dezacetoxi-cef-3-em-4-karbonsav-dimetilformamid szolvát szerkezetének. 500 mg kapott terméket átkristályosítottunk. 2 ml vízzel 5 percig kevertük, és 6 ml dimetilformamidot csepegtettünk hozzá 3 perc alatt. (A kristályosodás körülbelül 3 ml dimetilformamid hozzáadása után indult meg). A kristályszuszpenzíót 10 percig kevertük, szűrtük, a fehér kristályos anyagot 1 ml dimetilformamiddal (háromszor) és 10 ml acetonnal (négyszer) mostuk, először levegőn, majd vákuumban foszforpentoxid felett szárítottuk. 370 mg (74%) terméket kaptunk, amelynek az infravörös és MMR spektruma megfelelt a 7-lH')^-amino-a-(p-hidroxifenilace tamido)-dezace toxi -cef-3 -em-4-karbonsavénák, j óllehet szennyezésként kevés báriumot is tartalmazott. Ismételt átkristályosítással a következőképpen távolitottuk el a báriumsókat. 200 mg terméket körülbelül 6 ml 40 °C hőmérsékletű vízben oldottunk, acetonitrillel kezdődő zavarosodásig hígítottuk, és 10 perc múlva szűrtük. A szűrletet 7-D-(-)-a-amino-a-(p-hidroxifenilacetamido)-dezacetoxi-cef-3-em-4-karbonsav-monohidrát kristállyal beoltottuk, az oldatot állni hagytuk, 30 percig 25-30 °C-on és 30 percig 22 °C-on, majd a kristályokat szűrtük, acetonitrillel mostuk és levegőn megszárítottuk. 53 mg terméket kaptunk, bomláspont 208 °C. Infravörös spektrum: y-értékek (cnr1 ) 3500 és 3420 (OH), 3200 (NH), 2600-3100 (NHa+X 1755 (J3-Iaktám OO), 1670 (amid OO), 1610 (C=C), 1560 (COO- ). 2. példa 7 - D- ( - ) -a -a mi n o-a-(p-acetoxifenilacetamido)-dezacetoxi-cef-3-em-4-karbonsavat (p-acetoxicefalexin) 0,5 mg/ml koncentrációban tartalmazó oldatot készítünk fiziológiás sóoldattal, illetve humán szérummal. Standard oldatként 7-D-(-)-a-amino-a-(p-hidroxifenilace tamido)-dezacetoxi-cef-3-em-4-karbonsavat (p-hidroxicefalexin) ugyancsak 0,5 mg/ml koncentrációban tartalmazó oldatot készítettünk, mind fiziológiás sóoldattal, mind pedig humán szérummal. A fentiek szerint előállított oldatokat 37 °C-on inkubáltuk, miközben rázógépen rázattuk őket, és 0, 2, 4, 8 és 24 óra elteltével mintát vettünk kromatográfiás vizsgálat céljára. Az oldatokat Whatman No. 1 papírcsíkokra vittük fel. Egy-egy, körülbelül 1,3 cm szélességű papírcsíkra körülbelül 5 mikroliter mintát cseppentettünk fel, a papírcsíkokat megszárítottuk és 80 rész butilacetátot, 15 rész n-butanolt, 40 rész ecetsavat és 24 rész vizet tartalmazó oldószerelegyben futtattuk. A papírcsíkokat ezután Bacillus subtilis-szel beoltott lemezeken 6 pH-értéknél biológiai értékelésnek vetettük alá. A biokromatogramok azt mutatták, hogy a p-acetoxicefalexin gyorsan p-hidroxi származékká hidrolizál a humán szérumban, változatlan marad azonban a fiziológiás sóoldatban. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás 7-D-(-)-a-amino-a-(p-hidroxifenilacetamido)-dezacetoxi-cef-3-em-4-karbonsav, e vegyület hidrátjának vagy gyógyászatiig alkalmas sójának előállítására, azzal jellemezve, hogy 7-D-(-)-a-amino-a-(p-acetoxifenilacetamido)-dezacetoxi-cef-3-em-4-karbonsavat vizes oldatban 5,0-7,5 közötti pH-értéken adott esetben puffer jelenlétében észterázzal kezelünk, a képződő terméket önmagában ismert módon elkülönítjük és kívánt esetben a szabad savat vagy hidrátot önmagában ismert módon a megfelelő gyógyászatilag alkalmas sóvá alakítjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
