172960. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Streptomyces fradiae törzsek pronáz termelésének fokozására és pronáz fermentációjára
3 172960 4 is. Ha ezen antibiotikumok felhasználásával szelektáljuk a pronáz termeléséhez kiválasztott Streptomyces fradiae törzset, jobban termelő variánst kaphatunk. A találmány értelmében előnyösen úgy járunk el, hogy az antibiotikumos törzsszelekciót 7,0-7,5 pH-értékű táptalajon végezzük, mely pH tartományban az antibiotikumokkal szemben fokozott érzékenység figyelhető meg. A találmány értelmében a szelekcióhoz különféle antibiotikumokat alkalmazhatunk, mint pl. kanamicint, neomicint, streptomicint, és gentamicint. Az eljárás előnyösen kombinálható kémiai mutagénekkel történő kezeléssel. Célszerű, ha a törzs spóraszuszpenzióját N-metil-N’-nitro-N”-nitrozo guanidinnal (továbbiakban MNG) kezeljük, és ezután végezzük el enyhén lúgos, célszerűen pH 7,5 értéken az antibiotikummal történő törzsszelekciót. A kapott egyedek termelőképessége fokozottan tolódik el a magasabban termelő törzsek irányába. Az MNG helyett sikerrel alkalmazhatjuk az alábbi kémiai mutagéneket: azaszerin, 2,5-bisz(etiiénimino)-benzokinon, N -metil-bisz-(0-klóretil)-amin-hidroklorid, N-metil-bisz(0-klóretil)-amin-N-oxid-hidroklorid, 0-propioIakton, trietilénmelamin, szulfocidin (Applied Microbiol. 6, 23, 1958), etil-metilszulfonát, mustámitrogén, edlénimin stb. A szelektált törzs fermentációját a pronáz fermentációkhoz eddig alkalmazott körülmények között végezhetjük el. így a fermentációhoz alkalmazott táptalajban fehéijeforrásként előnyösen szójalisztet, kukoricalekvárt, mogyorólisztet, kazein vagy élesztőhidrolizátumot, szénhidrátforrásként keményítőt (amelyet alkalmazhatunk tisztított formában, vagy keményítőtartalmú szárított termények őrleményeként), ásványi sóként előnyösen ammóniumszulfátot, nátriumidoridot, és kalciumkarbonátot alkalmazunk. A találmány szerinti eljárás lényeges előnye, hogy egyszerű módon, biztos eredménnyel teszi lehetővé a Streptomyces fradiae törzs pronáz termelésének ielentős fokozását. Az eljárás részleteit az alábbi példákkal szemléltetjük. 1 1. példa P-102003 jelzésű Streptomyces fradiae törzs (melyet az OKI Mikroorganizmusok Nemzetközi Gyűjteményében 00144 sz. alatt deponáltunk 1975. novemberében) Czapek-Dox agáron nőtt spóratenyészetéről fiziológiás konyhasóoldattal (mely 0,5 tf/tf% Tween 80-at tartalmaz) spóraszuszpenziót készítettünk. A spóraszuszpenzió spóraszáma 6,6 • 108 ml volt. A spóraszuszpenziót centrifugáltuk és 9,0 pH-értékű trisz pufferben szuszpendáltuk. A 9 pH-jú trisz-puffert a következőképpen készítettük: 24,2 g trisz(hidroxi-metil)-aminometánt[(HO-CH2)3C-NH2 j desztillált vízben oldottunk, az oldatot 1 literre kiegészítettük (0,2 mólos oldat). 6,0 ml 0,1 n.HCl-hoz 25 ml 0,2 mólos trisz oldatot adtunk, majd desztillált vízzel lOOml-re egészítettük ki. A szuszpenziót N-metil-N’-nitro-N”-nitrozo-guanidin (MNG)-vel kezeltük különböző koncentrációk mellett. A letalitás a következőképpen változott: MNG gamma/ml Letalitás% 500 84,76 1000 99,13 2000 99,82 3000 99,99 Előkísérleteink alapján kezelési koncentrációnak a 3000 gamma/ml MNG-koncentrációt választottuk Az előzőekben elkészített spóraszuszpenziót olyan pH = 9 értékű trisz puffer-oldatban szuszpendáltuk, amelynek MNG koncentrációja 3000 gamma/ml volt. Két órán át 28 C°-on inkubáltunk, majd steril körülmények között centrifugáltunk, az üledéket steril fiziológiás konyhasóoldattal mostuk, majd ismét centrifugáltunk. A műveletet az MNG nyomainak eltávolítása céljából háromszor ismételtük, ezután szélesztést végeztünk Czapek-Dox agaros táptalajra, 28C°-on inkubáltunk, majd 7 nap után a kinőtt telepek közül 97-et izoláltunk. A spóráztató Czapek-Dox táptalaj összetétele: Szacharóz 3,0% NaN03 0,3% kh2po4 0,1% MgS04-7H20 0,05% KCL 0,05% FeS04 • 7H2 O 0,001% Agár 2,0% A pH érték sterilizés előtt 7,2, sterilezés után 7,0. A pronáz termelő-képességéi PF jelű táptalajon vizsgáltuk meg, melynek összetétele: 4% keményítő 2,5% szójaliszt 0,5% CaC03 0,5% NaQ 0,363% kh2po4 1,35% Na2HP04* 12 HjO 0,2% ammóniumszulfát 0,002% ZnS04- 7HjO 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
