172798. lajstromszámú szabadalom • Eljárás timozin alfa-1 előállítására
3 172798 4 kombinációja segítségével izoláljuk és állítjuk elő tiszta állapotban. A találmányunk tárgyát képező eljárást az jellemzi, hogy a) a liofüizált timozinfrakció 5-t karboximetücellulóz-oszlopon 10 mM nátriumacetátból és 1,0 mM 2-merkapto-etanolból álló pH = 5,0 értékű pufferben kromatografáljuk, az oszlopot előbb a fenti pufferrel mossuk, majd é pufferrel és e puffernek 1,0 mólos nátriumklorid-oldattal képezett elegyével lineáris gradiens módszenei eluáljuk, b) az a) lépésnél kapott első fehérje-csúcsot dextrángél-oszlopon (Sephadex G—25) steril víz felhasználása mellett frakcionáljuk, c) a b) lépésnél kapott második fehérje-csúcsot 8,0pH-jú 50 mM trisz/l,0mM 2-merkapto-etanol pufferrel egyensúlyba hozott 2-dietilaminoetil-cdlulóz (DE-32) oszlopra visszük fel, az oszlopot előbb ezzel a pufferrel, majd 1,3 liter fenti pufferrel és 1,3 liter 0,8 mól nátriumkloridot tartalmazó fenti pufferrel lineáris gradiens módszerrel eluáljuk, d) a c) lépés szerint kapott fehérje-csúcsok első hatodrészét tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd dextrángél-oszlopon (Sephadex G-75) 6,0 mól guanidin-hidrokloridból és 10 mM íriszből álló, 7,5 pH-jú pufferben továbbtisztítjuk, e) végül a d) lépésnél kapott fehérje-csúcs középső frakcióit dextrángél-oszlopon (Sephadex G-10) steril víz felhasználásával sómentesíljük. Az ily módon kapott tisztított fehérjefrakció (kitermelés 0,6%) a fentiekben megadott aminosavszekvenciának felel meg, a terméket timozinai -nek nevezzük. A készítmény szénhidrátokból és nukleotidoktól mentes. A szerkezetfelderítést és aminosavszekvencia-meghatározást általánosan használatos módszerekkel végezzük el (azaz tripszinnel, kimotripszinnel, termolizinnel vagy szubtilizinnel történő enzimes lebontással, a töredék-darabok papírelektroforézissel és/vagy kromatográfiás úton történő szétválasztásával és az egyes peptid-fragmentek Edman-féle lebontásával). Az alábbi táblázatban igazoljuk, hogy a timozinai három ismert biokísérletben 10-1000-szer erősebb biológiai aktivitást fejt ki mint a timuszfrakció 5. Az alábbi teszteket alkalmazzuk: mitogén-teszt egéren, Ümfokin-teszt (in vitro teszt, melynek segítségével a makrofágmigrációgátló faktor - MIF - termelését mérjük, E-rozetta-teszt emberi limfocitákon. Aktivitás (/ig) Limfokin- E-rozetta- Mitogénteszt teszt teszt Timozinfrakció 5 1—5 1—10 1—10 Timozina, 0,01-0,1 0,001-0,01 0,01-0,1 A timozinai embereknek és emlősállatoknak parenterális úton, éspedig intravénásán, szubkután vagy intramuszkulárisan adható be. Intravénás adagolás esetén a napi dózis általában 1—100/rg/kg testsúly. A napi dózis természetesen az adott eset körülményeitől függően változhat és a betegség fajtájától, erősségétől és időtartamától függ. A gyógyászati dózis-egység célszerűen 1 mg liofüizált timozinai-t tartalmaz, melyet röviddel felhasználás előtt steril víz vagy konyhasó-oldat hozzáadásával oldhatunk fel. Találmányunk továbbá a timozinai gyógyászatilag alkalmas sóinak — azaz savakkal és bázisokkal képezett sóinak - előállítására is kiterjed. A sók közül pl. a nátrium- vagy káliumsót, erős szerves bázisokkal (pl. guanidinnel) képezett sókat és savaddíciós sókat (pl. hidroklorid, hidrobromid, szulfát, foszfát, malát, maleát, acetát, citrát, szukcinát, benzoát ésaszkorbinát) említjük meg. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás timozinai előállítására timozin-frakció 5-ből azzal jellemezve, hogy a) a liofilizált timozin-frakció 5-öt karboximetücellulóz-oszlopon 5,0 pH-jú nátriumacetát/2-merkapto-etanol pufferben kromatografáljuk, az oszlopot előbb a fenti pufferrel mossuk, majd a fenti puffernek és a fenti puffernek 1,0 mólos nátriumklorid-oldattal képezett elegyével lineáris gradiens módszerrel eluáljuk, b) az a) lépésnél kapott első fehérje-csúcsot dextrángél-oszlopon (Sephadex G—25) frakcionáljuk, c) a b) lépés szerint kapott második fehérje-csúcsot 2-dietUaminoetü-cellulóZ'Oszlopon 8,0 pH-jú trisz/2-merkapto-etanol pufferben kromatografáljuk, az oszlopot előbb a fenti pufferrel, majd a fenti pufferrel és a fenti puffernek 0,8 mólos nátriumkloridoldattal képezett elegyével lineáris gradiens módszerrel eluáljuk, d) a c) lépésnél kapott fehérje-csúcsok első hatod-részét 7,5 pH-jú guanidin-hidroklorid/trisz pufferben dextrángél-oszlopra (Sephadex G—75) visszük, végül e) a d)-lépésnél kapott fehérje-csúcs középső frakcióit dextrángél-oszlopon (Sephadex G—10) sómentesítjük, és a timozinai-et elkülönítjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy az a) lépésnél 10 mM nátriumacetátból és 1,0 mM 2-merkapto-etanolból álló puffert alkalmazunk. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy a c) lépésnél 50 mM trisz-hidrokloridból és 1,0 mM 2-merkapto-etanolból álló puffért alkalmazunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
