172644. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cef-3-em-4-karbonsav-származékok előállítására
17 172644 18 rum alapján azonos az 5. példa szerint a 3-acetoximetil-származékból előállított vegyülettel. (b) 208 mg (6R,7R)-3-benzoiloximetil-7-[2-(fur- 2-il)-2-metoxiimino-acetamido ]-cef-3-em-4-karbonsav 5 (szín izomer) (35—105 C°-on bomlik) 3 ml vízzel készített szuszpenzióját telített vizes nátriumhidrogénkarbonátoldattal pH = 6,5 értékig semlegesítjük. Az elegyhez 3 ml 0,4 mólos foszfátpuffer-oldatot (pH = 6) és lg fagyasztott Rhodotorula rubra 10 CBS 6469 teljes sejteket tartalmazó pépet adunk, és az elegyet az (a) lépésben leírt módon kezeljük. A liofilizálás után kapott végtermék Rf-értéke és deutériumoxidban felvett NMR-spektruma megegyezik az 5. példa szerint kapott termékével. 15 10. példa (6R,7R)-7-Formamido-3-hidroximetil-cef- 20-3-em-4-karbonsav-difenilmetilészter előállítása 12,0 g (6R,7R)-3-acetoximetil-7-formamido-cef-3-em-4-karbonsav 1 290 327 sz. brit szabadalmi 25 leírás) 150 ml vízzel készített szuszpenzióját 1 mólos nátriumhidroxid-oldattal pH = 6 értékig semlegesítjük. A kapott oldatot 90 ml 0,4 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH = 6) hígítjuk, majd 61,5 g fagyasztott Rhodotorula rubra CBS 6469 teljes 30 sq'teket tartalmazó pépet adunk az elegyhez. A szuszpenziót 19 órán át erélyesen keverjük. Az elegyet centrifugáljuk, és a felső folyadékfázist dekantálással elkülönítjük. Az oldatot kovasavgélen szűrve derítjük. A szűrlethez 250 ml 4-metil-pen- 35 tan-2-ont, 500 ml metiléndikloridot és 30 ml etanolt adunk, és az elegyet nátriumkloriddal telítjük. Az elegyhez difenil-diazometán metiléndikloridos oldatát adjuk, majd az elegyet erélyes keverés közben, lassú ütemben adagolt 50%-os foszforsav- 40 -oldattal pH = 2 értékre savanyítjuk. Az elegyet további 3 órán át keverjük, majd a szerves fázist elválasztjuk, telített vizes nátriumklorid-oldattal mossuk, szárítjuk és vákuumban kis térfogatra bepároljuk. A kivált szilárd anyagot leszűrjük. 45 8,44 g finom, tűkristályos (6R,7R)-7-formamido-3- -hidroximetil-cef-3-em-4-karbonsav-difenilmetilésztert kapunk, op.:158C° (bomlás), (a)“ =+16,2° (c = 1,1%, acetonban), Xmax. (etanol): 268 nm (e7300). A termék infravörös és NMR spektruma 50 és elemi analízis-adatai megegyeznek a hiteles mintáéval: vmax (Nujol): 3460, 3320, 1741, 1710, 1651, 1518cm-1, r(DMSO-d6): 0,89, 1,78, 2,3-2,8, 3,02, 4,11, 4,80, 4,81, 5,71, 6,32 ppm. 11. példa (6R,7R)-7-[D-5-(N-benzoil-amino)-5- -karboxi-pentánamido]-3-hidroximetil-cef- 60-3-em-4-karbonsav előállítása 1 g (6R,7R)-7-[D-5-{N-benzoil-amino)-5-karboxi-pe ntánamido ]-3-acetoximet il-cef-3-em-4-karbonsa vat (1 041 985 sz. brit szabadalmi leírás) 100 ml 0,1 65 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH = 6) oldunk, és az oldatot azonos részletekben 10 db, egyenként 100 ml-es Erlenmeyer-lombikba töltjük. A korábban ismertetett táptalajon tenyésztett Rhodotorula rubra CBS 6469 sejtjeit 0,1 mólos foszfátpuffer-oldattal mossuk, az elegyet centrifugáljuk, majd a sejteket 0,1 mólos foszfátpuffer-oldatban szuszpendáljuk. Minden egyes lombikba 2,0 ml így kapott szuszpenziót töltünk, majd a lombikokat 245 fordulat/perc fordulatszámú, 5 cm lökethosszú forgó rázógépen 25 C°-on inkubáljuk. Az elegyből időről időre mintát veszünk, és a mintákat vékonyrétegkromatográfiás elemzésnek (adszorbens: cellulózzal bevont lemez, futtatószer: 70%-os vizes n-propanol) vetjük, alá. Nyomjelzőként a kiindulási anyag mintáját használjuk, amelynek Rf-értéke 0,69 . 72 óra elteltével a mintában kiindulási anyag már nem mutatható ki, és Rf=0,59 értéknél új vegyületre jellemző folt jelenik meg. Az oldatokat egyesítjük, és az élesztőt centrifugálással elkülönítjük. 100 ml így kapott oldathoz, amely körülbelül 1,6 mmól dezacetilezett terméket tartalmaz, 3,75 mmól difenil-diazometán 22 ml metilénklorid és 10 ml etilacetát elegyével készített oldatát adjuk. Az elegyet foszforsavval pH = 2,0 értékre savanyítjuk, és 30 percig keverjük. A difenildiazometán fölöslegét ecetsavval elbontjuk, majd a szerves fázist elválasztjuk a vizes fázistól. A szerves fázist egymás után 50 ml vízzel, 50 ml 5 vegyes %-os vizes nátriumhidrogénkarbonát-oldattal, majd ismét 50 ml vízzel mossuk. Az egyes mosófolyadékokat 15—15 ml metilénkloriddal extraháljuk. A szerves fázisokat egyesítjük, vízmentes magnéziumszulfát fölött szárítjuk, majd az oldatot vákuumban bepároljuk. Az olajos maradékot -10C°-os petroléterrel (forráspont-tartomány: 60—80 C°) eldörzsöljük, a kivált szilárd anyagot leszűrjük, és szobahőmérsékleten vákuumban szárítjuk. 0,70 g terméket kapunk, amely infravörös spektrum alapján (6R,7R)-7-[D-5-(N-benzoil-amino)-5-karboxi-pentánamido]-3-hidroximetil-cef-3-em-4-karbo nsav-dibenzhidrilészternek bizonyult .(nm ax (CHBr3): 3660-3404, 1787, 17 31 1678-1653 cm-1.) 12. példa 3-Hidro ximetil-7 0-(D-5 -amino -5 -karbo xi-pentánamido)-cef-3-em-4-karbonsav előállítása A 2. példában leírt eljárást ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a Rhodotorula-sejtek tenyésztése során a táptalajhoz nem adunk indukálószert. A dezacetilezés kromatográfiás elemzés alapján 18 óra elteltével ér véget, ekkor a reakcióelegy 6,05 mg/ml dezacetilezett végterméket tartalmaz. A 4 liter térfogatú fermentlevet a 2. példában leírt módon extraháljuk. 17,8 g terméket kapunk, amelynek tisztasági foka 74,0% (a szabad savra vonatkoztatva). A termék fizikai állandói azonosak a Biochem. J. 81, 591 (1961) közleményben megadottakkal. 9
