172644. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cef-3-em-4-karbonsav-származékok előállítására
7 172644 8 A hidrolízist rendszerint úgy indítjuk meg, hogy az észterázt a megfelelő 3-aciloximetil-cef-3-em-4- -karbonsav vagy -karbonsav-só (például alkálifémsó, így nátrium- vagy káliumsó) vizes oldatával hozzuk érintkezésbe. A vizes oldat általában 0,5-10 vegyes % 3-aciloximetil-cef-3-em-4-karbo nsa v-származékot tartalmazhat. Kívánt esetben a kiindulási anyag oldatát hidrolízis előtt sterilizálhatjuk, azt tapasztaltuk azonban, hogy a hidrolízis nem igényel steril körülményeket. Ha kiindulási anyagként fermentációs úton kapott 3-aciloximetil-cef-3-em-4-karbonsavat — például cefalosporin C-t — használunk fel, az észterázt közvetlenül a cefem-termelő mikroorganizmus (például valamely Cephalosporium-nemzetségbeli mikroorganizmus) tenyésztésével kapott fermentléhez adhatjuk, és így kiküszöbölhetjük a 3-aciloximetil-cef-3-em-4-karbonsav elkülönítését. Az észteráz beadagolása előtt a fermentléből előnyösen eltávolítjuk a micéliumokat. A hidrolízist általában 4 és 8 közötti pH-értéken hajtjuk végre. A reakció során például megfelelő pufferoldat, így foszfátpuffer felhasználásával 6,0 pH-értéket tarthatunk fenn. A hidrolízist általában szobahőmérsékleten — az körülbelül 25 C°-on - végezzük, előnyösen levegőztetés és/vagy keverés közben. Az észteráz vagy észtertartalmú anyag felhasználandó mennyiségét kis méretben végzett előkísérletekkel könnyen meghatározhatjuk. Tapasztalataink szerint a méretnagyítás az eljárás szempontjából nem okoz problémát. A 3-aciloximetil-cef-3-em-4-karbonsa vak teljes mértékű dezacilezéséhez szükséges idő a kiindulási anyag jellegétől és a reakció körülményeitől függően változik, a dezacilezés azonban rendszerint 20—70 órát vesz igénybe. A reakció menetét könnyen követhetjük úgy, hogy az elegyből időről időre mintát veszünk, a terméket vékonyrétegkromatográfiás vagy papírkromatográfiás úton elkülönítjük a mintából, majd denzitometriásan mérjük a termék mennyiségét. Ha a 7-es helyzetben D-5-amino-5-karboxi-pentánamido-csoportot tartalmazó 3-aciloximetil-cef-3- -em-4-karbonsavból - például cefalosporin C-ből - indulunk ki, a találmány szerinti hidrolitikus dezacilezést összekapcsolhatjuk a 7-es helyzetű csoport enzimes oxidációjával. Miként ismert, az enzimes oxidációhoz például gomba-eredetű oxidázokat, előnyösen a Trigonopsis variábilis élesztő-gombából elkülönített oxidázt (lásd az 1 272 769 és 1 348 359 sz. brit szabadalmi leírást) használhatunk fel, ekkor a 7-es helyzetben 4-karboxi-butánamido-csoportot tartalmazó végtermékekhez jutunk. A 3-as és 7-es helyzetű csoportok enzimes átalakítását egymást követően vagy egyidőben hajthatjuk végre. A 3-hidroximetil-cef-3-em-4-karbonsav végtermékeket az adott vegyület és a reakcióközeg jellegétől függő módszerekkel különíthetjük el. Az elkülönítést általában hagyományos módszerekkel végezzük, így például ha észteráz-forrásként teljes sejteket használhatunk fel, a sejteket szűréssel vagy centrifugálással elkülönítjük (és kívánt esetben újra felhasználjuk), majd az oldatot például kovasavgélen átvezetve derítjük. A cefalosporin C dezacetilezésével kapott 3-hidroximetil-vegyületet például úgy különíthetjük el, hogy az oldatot sómentesítés céljából aktív szénen vezetjük át, az aktív szenet acetonnal és vízzel eluáljuk, az eluátumot további tisztítás céljából anioncserélő gyantán (például acetát-formájú Amberlite IRA—68 gyantán) bocsátjuk át, a dezacetilezett terméket káliumacetát-oldattal leoldjuk, és az eluátumból acetonnal kicsapjuk a terméket. A 3-hidroximetil-cef-3-em-4- karbonsav-származékokat természetesen egyéb módszerekkel, például oldószeres extrakcióval, savas kicsapással vagy — ikerion-jellegű vegyületek, például (6R,7R)-7-amino-3-hidroximetil-cef-3-em-4-karbonsav esetén - izoelektromos ponton végzett kicsapással is elkülöníthetjük. A találmány szerinti eljárás általános előnye az, hogy a Rhodotorula-nemzetségbeli mikroorganizmusok tenyésztésével igen könnyen előállítható a megfelelő észterázforrás, az észteráz megfelelő mennyiségben termelhető, és a hidrolízis-reakció teljes mértékben reprodukálható. Amint már korábban közöltük, ipari és gazdaságossági szempontból különösen előnyös az az eljárásváltozat, amelynek során észteráz-forrásként teljes sejteket használunk fel. A találmány szerinti eljárásban felhasználható észteráz termelésére igen alkalmasnak találtuk a Rhodotorula rubra törzseket. E törzsek általunk leghatásosabbnak talált képviselőjét a Centraalbureau voor Schimmelcultures, Netherlands intézetben CBS 6469 számon helyeztük letétbe. A Rhodotorula rubra CBS 6469 törzs jellemzőit az alábbiakban ismertetjük. A vizsgálatokat a „The Yeasts - A Taxonomic Study” (J. Lodder, 2. kiadás, 1971) szakkönyvben leírt módon végeztük. Folyékony maláta-élesztő-glükóz-pepton táptalajon 24, illetve 72 órán át végzett tenyésztés után rövid, ovális, 2-4,5 ju x 2,5-5,5 p méretű, egyesével vagy párosával megjelenő sejteket képez. 1 havi tenyésztés után a folyadékfázisban nem-flokkuláló üledék jelenik meg, a folyadékfázis felszínén azonban sejtfilm vagy sejtgyűrű nem észlelhető. A sejtek csak igen kis mértékben futnak fel a kémcső falára. Maláta-élesztő-glükóz-pepton-agaron 72 órán át végzett tenyésztés után gömb-alakú vagy ovális 2-51± x 2,5-7 fi méretű, egyesével vagy párosával megjelenő sejteket képez. A sávtenyészeten 1 hónapos tenyésztés után élénk rózsaszín, nagyon fényes és nagyon sima sejtek jelennek meg. Lemeztenyészeten, burgonya-dextróz-agaron vagy kukoricaliszt-agaron 4 hétig tenyésztve pszeudomicélium-fejlődés nem észlelhető, répán, nátriumacet át-agaron vagy Gorodko va-agaron 3 vagy 4,5 héten át tenyésztve spóraképződés nem lép fel. Durham-cső módszerrel, dextróz, fruktóz, galaktóz, mait óz, szacharóz, laktóz, melibióz, raffinóz, trehalóz és oldható keményítő felhasználásával végzett cukor-fermentációs kísérletben 3 hét elteltével gázfejlődés nem észlelhető. Egyetlen szénforrásként glükózt, galaktózt, szacharózt, mahózt, L-szorbózt, cellobiózt, trehalózt, raffinózt, melecitózt, D-xilózt, L-arabinózt, D-arabinózt, D-ribózt, L-ramnózt, etanolt, glicerint, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
