172644. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cef-3-em-4-karbonsav-származékok előállítására
21 172644 22 7-(4-Karboxi-butánamido)-3-acetoximetil-cef-3-em-4-karbonsav dezacetilezése 3,5 ml 4 mg/ml koncentrációjú vizes 7/3-(4-karbo xi-butánamido)-3-acetoximetil-cef -3-em-4-karbonsav (1 272 769 sz. brit szabadalmi leírás) 0,5 ml 1 mólos foszfátpuffer-oldat (pH = 6,0) 0,5 ml víz és 0,5 ml Rhodotorula rubra CBS 6469 tenyészet elegyét éjszakán át forgó rázógépen, 25 C°-on inkubáljuk. Az összehasonlító kísérletben a fentivel azonos összetételű, azonban élesztő-tenyészetet nem tartalmazó elegyet a fentivel azonos módon kezelünk. Az elegyből mintát veszünk, és a mintát vékonyrétegkromatográfiás elemzésnek (adszorbens: cellulóz-lemez, futtatószer: 70%-os vizes n-propanol) vetjük alá. Az egyes komponensek mennyiségét denzitometriás úton határozzuk meg. Az élesztő-tenyészettel kezelt lombikokból elkülönített minták esetén a kiindulási anyag (Rf=0,62) eltűnt, és helyette új, Rf=0,47 értékű vegyület jelent meg. Az összehasonlító kísérletből származó minták híg savas kezelés hatására nem változnak, míg az élesztővel kezelt minták esetén a termék fokozott mozgékonyságú (Rf=0,50) anyaggá alakul. Ez az átalakulás jelzi, hogy az élesztővel kezelt elegyben 7-(4-karboxi-butánamido)-3-hidroximetil-cef-3-em-4- -karbonsav képződött. A kapott termék azonos a 7-(D-5-amino-5-karboxi-pentánamido)-3-hidroximetil-cef-3-em-4-karbonsavból Trigonopsis variábilisból származó D-aminosav-oxidázzal nátriumazid jelenlétében előállított vegyülettel. 15. példa 16. példa 7-(D-5-amino-5-karboxi-pentánamido)-3-acetoximetil-cef-3-em-4-karbonsav dezacetilezése poliakrilamid-gélbe ágyazott Rhodotorula-sejtekkel A korábban ismertetett módon Rhodotorula rubra CBS 6469 tenyészetet állítunk elő. 10 ml tenyészetet mosunk, centrifugálunk, majd a sejttömeget azonos térfogatú 0,1 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH = 6,0) szuszpendáljuk. A szuszpenziót 10 ml 40 vegyes %-os, pufferoldattal készített monomer akrilamid-oldat, 6 ml 2,3 vegyes %os, pufferoldattal készített N,N-metilén-bisz-akrilamid-oldat, 0,0375 g ammónium-perszulfát, 0,048 ml N,N,N,,N,-tetrametil-etilén-diamin és 34 ml 0,1 mólos foszfátpuffer-oldat (pH = 6,0) elegyéhez adjuk. A szuszpenzióba nitrogént buborékoltatunk, majd a szuszpenziót a polimerizáció teljessé válásáig jégfürdőbe merítjük. A kapott gél egy részét 20 mesh száltávolságú szitán extrudáljuk. Az így előállított finomszemcsés gélt pufferoldattal addig mossuk, amíg a mosófolyadékban már nem mutathatok ki élesztősejtek. 4,0 ml így kapott gél-szuszpenzió, 5)) ml 1 jO mólos foszfátpuffer-oldat (pH = 6,0) és 1,0 ml 10 vegyes %-os 7-(I>5-amino-5-karboxi-pentánamido)-3- -acetoximetil-cef-3-em-4-karbonsav [Cephalosporins and Penicillins, szerk.: E.JFlynn, kiadó: Academic Press (1972)] elegyét üveglombikban, forgó rázógépen 25 C6-on inkubáljuk. 42 óra elteltével az elegy vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat alapján 5,86 mg/ml dezacetilezett terméket és 0,78 mg/ml kiindulási anyagot tartalmaz. Az azonos körülmények között, azonban beágyazott élesztő-sejteket nem tartalmazó poliakrilamid-géllel végzett összehasonlító kísérlet esetén az elegy 42 óra elteltével csak 1£ mg/ml dezacetilezett terméket tartalmaz, amelynek fizikai állandói megegyeznek a Biochem. J. 81, 591 (1961) közleményben megadottakkal. A kiindulási anyag koncentrációja 5,48 mg/ml. 17. példa 7-(D-5-amino-5-karboxi-pentánamido)-3- -acetoximetil-cef-3-em-4-karbonsav dezacetilezése cellulózacetát-rostokra felvitt Rhodotorula-sejtekkel Rhodotorula rubra CBS 6469 mikroorganizmust 0,1 vegyes % cefalosporin C jelenlétében 72 órán át rázás közben tenyésztünk. A sejteket elkülönítjük, mossuk, centrifugáljuk, majd vízben szuszpendáljuk. Cellulóz-triacetátból metilénkloridban 5 vegyes %-os emulziót készítünk. Az emulziót rozsdamentes acéltűn keresztül gyors mágneses keveréssel örvénylésben tartott toluolba extrudáljuk. A toluolos közegből elkülönítjük a keverő körül kialakult végtelen fonalat, vízzel mossuk, és 4C°-os vízben tároljuk. A fonal mintáit szűrőpapírral szárazra itatjuk, majd 7 -(D-5-amino-5-karboxi-pentánamido)-3-acetoximetil-cef-3-em-4-karbonsav [Cephalosporins and Penicillins, szerk.: E. Flynn, kiadó: Academic Press (1972)] pufferoldattal készített oldatába helyezzük. Az elegyet forgó rázógépen 25 C°-on inkubáljuk, és az elegyből időről időre mintát veszünk. A minták kromatográfiás elemzése alapján az elegyben 2,75 mg/g rost/óra sebességgel dezacetilezett termék képződik. A rostokat elkülönítjük az inkubált elegyből, vízzel mossuk, majd a fenti dezacetilezéshez ismét felhasználjuk Az újra felhasznált rostok esetén a dezacetilezett termék 4,15 mg/g rost/óra sebességgel alakul ki. A dezacetilezett termék fizikai állandói azonosak a Biochem. J. 81, 591 (1961) közleményben megadottakkal. 18. példa 7-(D-5-amino-5-karboxi-pentánamido)-3-acetoximetil-cef-3-em-4-kar bonsav dezacetilezése Rhodotorula glutinisből elkülönített sejtmentes enzimmel 6 db 250ml-es lombikba darabonként 40 ml élesztő-táptalajt töltünk. A táptalajt 1 ml Rhodotorula glutinis CBS 20 fermentlével oltjuk be, és 72 órán át forgó rázógépen, 25C°-on inkubáljuk. A kapott tenyészeteket egyesítjük, és 20 percig 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
