172619. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimes analizishez
7 172619 8 A folyamatábra az 1. ábra rajzán látható, ahol 1 tömlőszivattyú 4 levegő (0,4 ml/min) 2 minta (0,1 ml/min) 5 H20 (2,0 ml/min) 3 HjO (2,0 ml/min) 6 hígított minta (0,16 ml/min) 7 reagens (1,0 ml/min) 8 levegő (0,2 ml/min) 9 melegítő készülék (37 C°) 10 fotométer 11 elfolyás b) Találmány szerinti eljárás A következő reagenseket használjuk, 1. reagens: 0,4 M kálium-foszfát puffer, pH = 7,2, 4 térfogat% metanol, 0,1 E/ml koleszterin-oxidáz, 0,1 E/ml koleszterin észteráz, 2,5 E/ml peroxidáz, 2. reagens: 1,2 g 4-amino-antipirin, 0,6 g fenol, 5 ml POD 100 ml kétszer desztillált vízben. A meghatározást a 2. ábrán szemléltetett folyamatábra szerint végezzük, ahol 1 szivattyú 8 levegő (0,2 ml/min) 2 minta (0,1 ml/min) 9 2. sz. reagens (0,05 ml/min) 3 H20 (2,0 ml/min) 10 melegítő készülék, 37 C° 4 levegő (0,4 ml/min) 11 reaktor 5 HjO (2,0 ml/min) 12 fotométer 6 hígított minta 13 elfolyás (0,16 ml/min) 7 1. sz. reagens (1,0 ml/min) A 2. ábra rajzán bemutatott folyamatábra szerint az oldatot körfolyamatban vezetjük, amelybe 20 g faszenet tartalmazó reaktort iktatunk be. A faszenet 2 óráig 6%-os albuminoldatban inkubáljuk, majd reaktorként szolgáló, függőlegesen álló oszlopba töltjük be. A reagens, amely a reakció folyamán képződő kinoidális festékanyagot tartalmazza, átfut az oszlopon. Az oszlopban a festék, 4-amino-antipirin, részben fenol és POD adszorbeálódik. Az enzimek akadály nélkül keresztülhaladnak. A 2. reagenst folyamatosan adagoljuk, hogy fenntartsuk a szükséges fenol-, 4-amino-antipirin- és detergenskoncentrációt. Ezzel a munkamódszerrel az 1. reagens használata mellett - amely az ismert eljárásoknál 30 perces műveleti időnek megfelelően 30 meghatározásra elegendő - az eljárás 390 percig folyik, anélkül, hogy az enzimaktivitás csökkenése megfigyelhető lenne. Ezalatt 130 vizes koleszterin-standard - koncentrációjuk egyenként 50-400 mg koleszterin) 100 ml - és 140 szériumminta elemzése megy végbe változatlan pontossággal. A fennmaradó idő a reagensek alapextinkciójának (= bázisvonal) megállapítására fordítódik. Eközben semmi változást nem lehet megfigyelni, jeléül annak, hogy a kinoidális festékanyag mennyiségileg adszorbeálódott. Az enzimeket ennél a kísérletnél 13-szor használhattuk fel újra és ezzel az enzim-költségek - melyek a minta költségeinek mintegy 2/3-át teszik ki - 13-ad részükre csökkentek. 2. példa . Glükóz-meghat ározás hexokináz-módszerrel A meghatározás a következő reakcióegyenletek szerint folyik le: Glükóz + ATP-ÎÏ* glükóz—6—P + ADP Glükóz-6—P +NAD G~6~P~Dt? glükonát-6- + NADH (HK = hexokináz, ATP = adenozin-trifoszfát, ADP = adenozin-difoszfát, G-6—P—DH =glükóz-6- -foszfát-dehidrogenáz, Leuconostoc mikroorganizmusból előállítva). Az eljárást szokványos automata-analizátoron dialízissel és légbuborékokkal elkülönített mintákon hajtjuk végre. a) Hagyományos módszer [Clinical Chemistry, 18. kötet. 6. szám, 509—511. o. (1972)]. A következő összetételű és aktivitású reagenst használjuk: 0,075 M trietanol-amin puffer, pH = 7,8, 1 mM magnézium-szulfát, 3,5 mM NAD, 0,455 mM ATP, 1 E/ml HK, 1 E/ml G— 6^-P— DH (leuconostoc mikroorganizmusból előállítva), 0,1% detergens (polietilénglikol-éter). A folyamatábrát a 3. ábra rajza szemlélteti, ahol 1 tömlőszivattyú 5 reagens (1,0 ml/min) 2 minta (0,1 ml/min) 6 levegő (0,2 ml/min) 3 H20 (1,0 ml/min.) 7 dializátor 4 levegő (0,2 ml/min) 8 melegítőkészülék vagy 25 C° szobahőmérséklet 9 fotométer 10 elfolyás. b) Találmány szerinti eljárás A 4. ábra rajzán bemutatott folyamatábra szerint járunk el. Az ábrán 1 tömlőszivattyú 2 minta (0,1 ml/min) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
