172223. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy diszulfidhídon kívól legalább egy ciszteingyököt tartalmazó peptidek előállítására
19 172223 20 hűtjük és utána 191 ml 1 n sósavval semlegesítjük. A reakcióelegyet felére betöményítjük és 950 ml víz hozzáadása útján a nyersterméket kicsapjuk. A pH-t 1 n nátriumhidroxid-oldattal 7,0 értékre állítjuk be, éjszakán át 0°-on állni hagyjuk, szűréssel elkülönítjük, vízzel mossuk az elkülönített terméket és szárítjuk. Tisztítás végett 680 lépcsőben (10: 3 : 5 : 4 arányú) metanol—1 n ecetsav—kloroform—széntetraklorid rendszerben megosztjuk a terméket. A készülék egy 200 megosztóelemmel rendelkező és elemenként 25 ml fázistérfogatú, körfolyamatban dolgozó berendezés. A tiszta hexadekapeptidet az 540—594 csövekből (r max =550; K =4,2) különítjük el gélképződésig történő betöményítés és liofilizálás útján. A kötött ecetsav eltávolítása végett a terméket trifluoretanolban oldjuk, 5-szörös térfogatú vizet adunk hozzá, a pH-t 7,0-es értékre állítjuk be és éjszakán át — 10°-on állni hagyjuk, utána szűrjük, 5 mossuk és szárítjuk. Ily módon amorf, nehezen oldható port kapunk, amely körülbelül 230°-on bomlik. Vékonyrétegkromatogramban szilikagélen Rf43C = =0,3; Rf52A =0,3; Rf70 =0,5; Rfu0 =0,45. 10 A III fragmentet a 2 346 147 számú NSZK-beli nyilvánosságrahozatali iratban leírt IV f ragmen ttel a védett 14—21 A-lánc + védett 1—30 B-lánc (VI) származékká kondenzáljuk a következő módon: 14 15 16 17 18 19 20 21 19. Bpoc-Tyr(But)-Gln-Leu-Glu(OBut)-Asn-Tyr(But)-Cys-Asn-OBut Boc-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-Ser(But)-His-Leu-Val-Glu(OBut)-Ala-Leu-Tyr-(But)-Leu-Val-Cys-Gly- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 -Glu(OBut)-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr(But)-Thr(But)-Pro-Lys(Boc)-Thr-(But)-OBut 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 2,12 g 18. pontban leírt terméket (III) és 2,74 g alábbi képletű vegyületet, amely hidrokloridként van jelen, 14 15 16 17 18 19 20 21 Bpoc-Tyr(But)-Gln-Leu-Glu(OBut)-Asn-Tyr(But)-Cys-Asn-OBut I H-Leu-Val-Cys-Gly-Glu(OBut)Arg-Gly-Phe-Tyr(But)-Thr(But)-Pro-Lys(Boc)- 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Thr(But)-OBut 30 valamint 0,94 g N-hidroxibenzotriazolt (hidrát) feloldunk 92 ml DMF-ben 45°-on, az oldathoz hozzáadunk 0,63 g diciklohexilkarbodiimidet és az elegyet 4 V2 óra hosszat 45°-on keverjük. Az elegyet azután 850 ml éterbe becsepegtetjük, a finom pelyhes csapadékot szűréssel elválasztjuk és éterrel mossuk. A nyersterméket ellenáramú megosztással (10: 3 : 5 :4 arányú) metanol—0,1 mólos ammóniumacetát (pH = =7,0)-kloroform—széntetraklorid rendszerben tisztítjuk. 1200 megosztási lépés után a termék a 15—42 csövekben található; K =0,03. Az anyag vékonyrétegkromatogramban szilikagélen a következő értékeket mutatja: RfI02A =0,50; RfJ2A = =0,55; Rfioo =0,45. 14 15 16 17 18 19 20 21 20. H-Tyr(But)-GIn-Leu-Glu(OBut)-Asn-Tyr(But)-Cys-Asn-OBut 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18—_19 Boc-Phe-Val-Asn-Glu-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-Ser(But)-His-Leu-Val-Glu(OBut)-Ala-Leu-Tyr-(But)-Leu-Val-Cys- 20 -GlyGlu(OBut)-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr(But)-Thr(But)-Pro-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut (VII) E példa 19. pontjában leírt módon előállított (VI) képletű termékből a Bpoc-csoport a 2 346 147 számú NSZK-beli nyilvánosságrahozatali iratban leírt eljárás szerint lehasitható és így a fenti (VII) képletnek megfelelő termék keletkezik. 1,1 g 19. pont szerint előállított (VI) képletű terméket 150 ml 90%-os trifluoretanolban oldunk, az oldat pH-ját 0,12 n, 90%-os trifluoretanollal készített sósavoldattal 0,5 értékre állítjuk és egy pH-szabályozóval ezen az értéken tartjuk. Az oldathoz 1 l/2 óra elteltével 1 ml piridint adunk és utána az oldatot szárazra pároljuk. A maradékot éterrel kétszer eldörzsöljük, szűrjük és szárítjuk. A termék (a VII képletű vegyület hidrokloridja) vé- 60 konyrétegkromatogramban szilikagélen a következő értékeket mutatja: R^a =0.25; Rnoo =0,30; Rf43C — =0,40; Rfl02A =0,35. A VII fragmentet a 3. pontban leírt V fragmenttei az emberi inzulin (VIII) egy diszulfidhídon keresztül 65 összekapcsolt védett A és B aminosavaivá kondenzáljuk ■: 10
