172223. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy diszulfidhídon kívól legalább egy ciszteingyököt tartalmazó peptidek előállítására
7 172223 8-hidroxibenzotiazol adagolása közben) vagy N,N'-karbonil-diimidazollal való reakció útján, az amino-csoportot pedig például foszfitamiddal történő reakció útján aktiválhatjuk. A leggyakrabban alkalmazott módszerek példáiként a karbodiimidmódszert, az azinmódszert, az aktivált észterek módszerét és az anhidridmódszert, továbbá a Merrifield-módszert és az N-karboxianhidridek vagy az N-tiokarboxianhidridek módszerét nevezzük meg. A találmány szerinti eljárás tetszés szerinti cisztintartalmú peptidek vagy peptid-származékok szintézisénél alkalmazható. Származékokon különösen peptidamidokat értünk, továbbá olyan peptideket vagy peptidamidokat kell érteni, amelyekben funkcionális csoportok, így például amino-csoportok, karboxil-csoportok, hidroxil-csoportok, ismert módon védve vannak, olyan vegyületek is értendők továbbá, amelyek egy vagy több cisztin-fél helyett (3-merkaptopropionsavgyököket (dezaminocisztint) tartalmaznak. Cisztintartalmú peptideken a találmány szerinti eljárás értelmében olyan peptideket is érteni kell, amelyek ugyanabban a láncban több cisztingyököt tartalmaznak, de olyan peptidek is értendők, amelyekben egy vagy több diszulfidhíd különböző aminosavakat kapcsol össze, ez az eset például az A-lánc (7-es helyzet) és a B-lánc (7-es helyzet) cisztingyöke, valamint A-lánc (20-as helyzet) és a B-lánc (19-es helyzet) vonatkozásában. Egy diszulfidhídnak ugyanabban a láncban és egy második diszulfidhídnak két különböző lánc közötti előfordulására példa az inzulin A-láncának 6-os és 11-es helyzetében levő cisztincsoport, valamint az A-lánc 7-es helyzetében és a B-lánc ugyancsak 7-es helyzetében levő cisztin-csoport. A találmány kiterjed egy új inzulin-előállítási eljárásra is, amelynek során merkapto-védőcsoportok említett kombinációját és ezeknek valamely polihalogénezett oxivagy oxovegyületben való lehasítását alkalmazzuk. Erre az eljárásra az jellemző, hogy olyan aminosavat állítunk elő, amely az A-lánc legalább 6—11 aminosavait tartalmazza, amelyek amino-, karboxil- és/vagy hidroxil-csoportjai adott esetben ugyancsak védve vannak és amelyben a 6- és 11-helyzetben levő cisztein-csoportok aralkiltípusú Rt védőcsoporttal és a 7-es helyzetű cisztein-csoport egy R2 acilaminometil-csoporttal védve van, jellemző továbbá, hogy az előállított aminosavban az Rj védőcsoportokat valamely polihalogénezett oxi- vagy oxovegyületben diszulfidhíd kialakítása közben jóddal lehasitjuk és azután — adott esetben — az A-láncnak az amino- és/vagy karboxilcsoport felé történő meghosszabbítása után, egy olyan aminosavval, amely az A-lánc cisztinjének a diszulfidhídját 20-as helyzetben, a B-láncét pedig 19-es helyzetben tartalmazza, kondenzáljuk, mimellett egy adott esetben ebben az aminosavban a B-lánc 7-es helyzetében levő cisztein-csoportot egy R2 acilaminometil-csoporttal megvédjük, ezután az A-láncot és a B-láncot, kívánt esetben, teljessé tesszük, mimellett a B-lánc 7-es helyzetében levő cisztein-csoportot egy R2 aminometil-csoporttal megvédjük, az amino-, karboxil- és/vagy hidroxil-védőcsoportokat lehasitjuk és e lehasítás előtt vagy után, az A- és B-lánc mindkét cisztein7-gyöke között az R2 acilaminometil-csoportok lehasítása és adott esetben diszulfidhíddá való oxidáció útján a diszulfidhidat kialakítjuk. A különböző diszulfidkötések kialakításának itt megadott sorrendje különösen kedvező. Ezt a sorrendet azonban meg is változtathatjuk. így például olyan pepiidet építhetünk fel. amely az inzulin A- és B-láncait 5 A 2CT 10 15 20 25 B19 diszulfidhíddal összekötve tartalmazza. Ebben az A(7) és B(7) ciszteingyökök R, védőcsoporttal, míg az A(6) és A(ll) ciszteingyökök R2 acilaminocsoportokkal védhetők. Ezután a megadott módon először az A7----»B7 diszulfid képződik és végül az A6----*-An diszulfidgyűrű szintézise jön létre. A találmányt a következő példákon szemléletesen is bemutatjuk. A hőmérsékleteket Celsius-fokokban adjuk meg. A példákban a következő rövidítéseket használjuk: Boc = terc-butiloxikarbonilcsoport Acm =acetilaminometilcsoport Trt = tritilcsoport Z =karbobenziloxicsoport But =terc-butilcsoport Me =metilcsoport Bpoc = 2-(p-bifenilil)-2-propoxikarbonilcsoport ONp =p-nitrofenilésztercsoport OSu = N-hidroxiszukcinimidésztercsoport DMF =dimetilformamid. A vékonyrétegkromatográfiában a következő rendszereket alkalmazzuk : 3-as rendszer: etilacetát—piridin—víz (65 : 20: 15) 43A rendszer: terc-amilalkohol—izopropanol—víz (67 : 26: 7) terc-amilalkohol—izopropanol—víz (51: 21: 28) terc-amilalkohol—izopropanol—víz (32:32:36) 45-ös rendszer: szek-butanol—3%-os vizes ammónia (70: 30) n-butanol—jégecet—víz (75 : 7,5: 21) n-butanol—jégecet—víz (67 : 10 : 23) etilacetát—piridin—víz (40: 20: 40), felsőfázis izopropanol—hangyasav—víz (77:4:19) 100- as rendszer: etilacetát—piridin—jégecet—víz (62: 21: 6: 11) 101- es rendszer: n-butanol—piridin—jégecet—víz (38: 24: 8: 30) 101A rendszer: n-butanoi—piridin—jégecet—víz (42 : 24: 4: 30) 102A rendszer: etilacetát—metiletilketon—hangyasav— —víz (50: 30: 10: 10) 107-es rendszer: etilacetát—piridin—víz (49 : 24 : 27) 110-es rendszer: etilacetát—n-butanol—piridin—jégecet—víz (42: 21: 21: 6 : 10) 112A rendszer : n-butanol—piridin—hangyasav—víz (42 : 24 : 4 : 20) 115-ös rendszer: etilacetát—piridin—hangyasav—víz (63 : 21: 10: 6). 30 43C rendszer: 43E rendszer: 35 52-es rendszer: 52A rendszer : 70-es rendszer: 40 87-es rendszer: 45 50 55 1. példa 60 H-Cys-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-Ile-Cys-Ser(But)-Leu-OH 0,47 g H-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-Ile- 65 -Cys(Trt)-Ser(But)-Leu-OH 15 ml trifluoretanollal készí-4
